B altymai yra esminė visų organizmų sudedamoji dalis. Kiekviena jo molekulė susideda iš vienos ar daugiau polipeptidinių grandinių, susidedančių iš aminorūgščių. Nors gyvybei reikalinga informacija yra užkoduota DNR arba RNR, rekombinantiniai b altymai organizmuose atlieka labai įvairias biologines funkcijas, įskaitant fermentinę katalizę, apsaugą, palaikymą, judėjimą ir reguliavimą. Pagal savo funkcijas organizme šias medžiagas galima suskirstyti į skirtingas kategorijas, tokias kaip antikūnai, fermentai, struktūrinis komponentas. Atsižvelgiant į jų svarbias funkcijas, tokie junginiai buvo intensyviai tiriami ir plačiai naudojami.
Anksčiau pagrindinis būdas gauti rekombinantinį b altymą buvo jį išskirti iš natūralaus š altinio, o tai paprastai yra neveiksminga ir atima daug laiko. Naujausi biologinės molekulinės technologijos pasiekimai leido klonuoti DNR, koduojančią tam tikrą medžiagų rinkinį, į ekspresijos vektorių, skirtą tokioms medžiagoms kaip bakterijos, mielės, vabzdžių ląstelės ir žinduolių ląstelės.
Paprasčiau tariant, rekombinantiniai b altymai yra paverčiami egzogeniniais DNR produktaisgyvos ląstelės. Jų gavimas paprastai apima du pagrindinius veiksmus:
- Molekulės klonavimas.
- B altymų išraiška.
Šiuo metu tokios struktūros gamyba yra vienas iš galingiausių metodų, naudojamų medicinoje ir biologijoje. Kompozicija plačiai taikoma moksliniuose tyrimuose ir biotechnologijose.
Medicinos kryptis
Rekombinantiniai b altymai yra svarbus įvairių ligų, tokių kaip diabetas, vėžys, infekcinės ligos, hemofilija ir anemija, gydymas. Tipiškos tokių medžiagų formulės yra antikūnai, hormonai, interleukinai, fermentai ir antikoaguliantai. Auga rekombinantinių preparatų, skirtų terapiniam naudojimui, poreikis. Jie leidžia išplėsti gydymo metodus.
genetiškai sukurti rekombinantiniai b altymai atlieka pagrindinį vaidmenį gydomųjų vaistų rinkoje. Žinduolių ląstelės šiuo metu gamina daugiausiai gydomųjų medžiagų, nes jų formulės gali gaminti aukštos kokybės natūralias medžiagas. Be to, dėl geros genetikos, greito augimo ir didelio produktyvumo E. coli gaminama daug patvirtintų rekombinantinių terapinių b altymų. Tai taip pat teigiamai veikia vaistų, kurių pagrindą sudaro ši medžiaga, kūrimą.
Tyrimai
Rekombinantinių b altymų gavimas grindžiamas skirtingais metodais. Medžiagos padeda išsiaiškinti pagrindinius ir pamatinius organizmo principus. Šios molekulės gali būti naudojamos identifikuoti ir nustatytikonkretaus geno koduojamos medžiagos vietą ir atskleisti kitų genų funkciją įvairiose ląstelių veiklose, tokiose kaip ląstelių signalizacija, metabolizmas, augimas, replikacija ir mirtis, transkripcija, vertimas ir straipsnyje aptartų junginių modifikavimas.
Todėl stebima kompozicija dažnai naudojama molekulinėje biologijoje, ląstelių biologijoje, biochemijoje, struktūriniuose ir biofizikiniuose tyrimuose bei daugelyje kitų mokslo sričių. Tuo pačiu metu rekombinantinių b altymų gavimas yra tarptautinė praktika.
Tokie junginiai yra naudingi įrankiai norint suprasti tarpląstelinę sąveiką. Jie pasirodė veiksmingi taikant kelis laboratorinius metodus, tokius kaip ELISA ir imunohistochemija (IHC). Rekombinantiniai b altymai gali būti naudojami fermentų tyrimams kurti. Naudojant kartu su tinkamų antikūnų pora, ląstelės gali būti naudojamos kaip naujų technologijų standartas.
Biotechnologijos
Rekombinantiniai b altymai, turintys aminorūgščių seką, taip pat naudojami pramonėje, maisto gamyboje, žemės ūkyje ir bioinžinerijoje. Pavyzdžiui, gyvulininkystėje į maistą galima dėti fermentų, siekiant padidinti pašarų sudedamųjų dalių maistinę vertę, sumažinti išlaidas ir atliekas, palaikyti gyvūnų žarnyno sveikatą, pagerinti produktyvumą ir gerinti aplinką.
Be to, pieno rūgšties bakterijos (LAB) ilgą laikąbuvo naudojami fermentuotiems maisto produktams gaminti, o neseniai LAB buvo sukurtas rekombinantiniams b altymams, turintiems aminorūgščių seką, ekspresijai, kuris gali būti plačiai naudojamas, pavyzdžiui, siekiant pagerinti žmonių, gyvūnų ir maistinių medžiagų virškinimą.
Tačiau šios medžiagos turi ir apribojimų:
- Kai kuriais atvejais rekombinantinių b altymų gamyba yra sudėtinga, brangi ir atima daug laiko.
- Ląstelėse gaminamos medžiagos gali neatitikti natūralių formų. Šis skirtumas gali sumažinti terapinių rekombinantinių b altymų efektyvumą ir netgi sukelti šalutinį poveikį. Be to, šis skirtumas gali turėti įtakos eksperimentų rezultatams.
- Pagrindinė visų rekombinantinių vaistų problema yra imunogeniškumas. Visi biotechnologijų produktai gali turėti tam tikrą imunogeniškumą. Sunku numatyti naujų gydomųjų b altymų saugumą.
Apskritai, biotechnologijų pažanga padidino ir palengvino rekombinantinių b altymų gamybą įvairioms reikmėms. Nors jos vis dar turi tam tikrų trūkumų, šios medžiagos yra svarbios medicinoje, moksliniuose tyrimuose ir biotechnologijose.
Ligos nuoroda
rekombinantiniai b altymai nėra kenksmingi žmonėms. Tai tik neatskiriama bendros molekulės dalis kuriant konkretų vaistą ar mitybos elementą. Daugelis medicininių tyrimų parodė, kad priverstinė FGFBP3 b altymo (sutrumpintai BP3) ekspresija nutukusių pelių laboratorinėje padermėje žymiai sumažino jų kūno riebalų kiekį.masė, nepaisant genetinio polinkio vartoti.
Šių tyrimų rezultatai rodo, kad FGFBP3 b altymas gali pasiūlyti naują gydymą su metaboliniu sindromu susijusiems sutrikimams, tokiems kaip 2 tipo diabetas ir suriebėjusių kepenų liga. Tačiau kadangi BP3 yra natūralus b altymas, o ne dirbtinis vaistas, klinikiniai rekombinantinio žmogaus BP3 tyrimai gali prasidėti po paskutinio ikiklinikinių tyrimų etapo. Tai yra, yra priežasčių, susijusių su tokių tyrimų sauga. Rekombinantinis b altymas nėra kenksmingas žmonėms dėl laipsniško apdorojimo ir gryninimo. Pokyčiai vyksta ir molekuliniame lygmenyje.
PD-L2, vienas iš pagrindinių imunoterapijos dalyvių, buvo nominuotas 2018 m. Nobelio fiziologijos ir medicinos premijai gauti. Šis darbas, kurį pradėjo prof. Jamesas P. Allisonas iš JAV ir prof. Tasuku Honjo iš Japonijos, paskatino vėžinių susirgimų, tokių kaip melanoma, plaučių vėžys ir kt., gydymą, paremtą kontrolinio taško imunoterapija. Neseniai AMSBIO savo imunoterapijos liniją papildė nauju svarbiu produktu – PD-L2/TCR aktyvatoriumi – CHO Recombinant Cell Line.
Atlikdami koncepcijos įrodymo eksperimentus, Alabamos universiteto Birmingeme mokslininkai, vadovaujami medicinos mokslų daktaro H. Long Zheng, profesoriaus Roberto B. Adamso ir laboratorinės medicinos direktoriaus, Patologijos katedros, UAB School of Medicina pabrėžė galimą reto, bet mirtino kraujavimo sutrikimo, TTP, gydymą.
To rezultataityrimai pirmą kartą rodo, kad rADAMTS13 pakrautų trombocitų perpylimas gali būti naujas ir potencialiai veiksmingas arterijų trombozės, susijusios su įgimta ir imuninės sistemos sukelta TTP, gydymo būdas.
Rekombinantinis b altymas yra ne tik maistinė medžiaga, bet ir kuriamo vaisto sudėtyje esantis vaistas. Tai tik kelios sritys, kurios dabar yra susijusios su medicina ir yra susijusios su visų jos struktūrinių elementų tyrimais. Kaip rodo tarptautinė praktika, medžiagos struktūra leidžia molekuliniu lygmeniu susidoroti su daugeliu rimtų žmogaus kūno problemų.
Vakcinos kūrimas
Rekombinantinis b altymas yra specifinis molekulių rinkinys, kurį galima modeliuoti. Panaši savybė naudojama kuriant vakcinas. Nauja vakcinacijos strategija, dar žinoma kaip specialios rekombinantinio viruso injekcijos naudojimas, gali apsaugoti milijonus viščiukų, kuriems gresia rimta kvėpavimo takų liga, teigė Edinburgo universiteto ir Pirbraito instituto mokslininkai. Šiose vakcinose naudojamos nekenksmingos arba silpnos viruso ar bakterijos versijos, kad į organizmo ląsteles patektų mikrobų. Šiuo atveju ekspertai naudojo rekombinantinius virusus su skirtingais smaigalių b altymais kaip vakcinas, kad sukurtų dvi nekenksmingo viruso versijas. Šiuo ryšiu sukurta daug įvairių vaistų.
Rekombinantinių b altymų prekiniai pavadinimai ir analogai yra tokie:
- „Fortelizin“.
- „Z altrap“.
- „Eylea“.
Tai daugiausia vaistai nuo vėžio, tačiau yra ir kitų gydymo sričių, susijusių su šia veikliąja medžiaga.
Nauja vakcina, dar vadinama LASSARAB, skirta apsaugoti žmones nuo Lassa karštinės ir pasiutligės, parodė daug žadančių ikiklinikinių tyrimų rezultatų, rodo naujas tyrimas, paskelbtas moksliniame žurnale Nature Communications. Inaktyvuota rekombinantinė vakcina naudoja susilpnintą pasiutligės virusą.
Tyrėjų komanda įterpė Lassa viruso genetinę medžiagą į pasiutligės viruso vektorių, kad vakcina ekspresuotų paviršiaus b altymus ir Lassa, ir pasiutligės ląstelėse. Šie paviršiaus junginiai sukelia imuninį atsaką prieš infekcinius agentus. Tada ši vakcina buvo inaktyvuota, kad būtų „sunaikintas“gyvas pasiutligės virusas, naudojamas nešiotojui sukurti.
Gauti metodus
Yra keletas medžiagų gamybos sistemų. Bendrasis rekombinantinio b altymo gavimo būdas yra pagrįstas biologinės medžiagos gavimu iš sintezės. Tačiau yra ir kitų būdų.
Šiuo metu yra penkios pagrindinės išraiškos sistemos:
- E. coli ekspresijos sistema.
- Mielių išraiškos sistema.
- Vabzdžių ląstelių ekspresijos sistema.
- Žinduolių ląstelių ekspresijos sistema.
- Be ląstelių b altymų ekspresijos sistema.
Pastarasis variantas ypač tinka transmembraninių b altymų ekspresijaiir toksiški junginiai. Pastaraisiais metais į ląsteles in vitro buvo sėkmingai integruotos medžiagos, kurias sunku išreikšti įprastiniais tarpląsteliniais metodais. B altarusijoje plačiai naudojama rekombinantinių b altymų gamyba. Yra keletas valstybinių įmonių, kurios sprendžia šią problemą.
Proteinų sintezės sistema be ląstelių – tai greitas ir efektyvus tikslinių medžiagų sintezės metodas, pridedant įvairių substratų ir energetinių junginių, reikalingų transkripcijai ir vertimui į ląstelių ekstraktų fermentinę sistemą. Pastaraisiais metais pamažu išryškėjo beląstelinių metodų, taikomų tokioms medžiagoms, kaip sudėtingos, toksiškos membranos, pranašumai, o tai rodo galimą jų pritaikymą biofarmacijos srityje.
Technologija be ląstelių gali lengvai ir kontroliuojamai pridėti įvairių natūraliai neatsirandančių aminorūgščių, kad būtų pasiekti sudėtingi modifikavimo procesai, kuriuos sunku išspręsti po įprastinės rekombinantinės ekspresijos. Tokie metodai turi didelę taikymo vertę ir potencialą vaistų tiekimui bei vakcinų kūrimui naudojant į virusus panašias daleles. Daugybė membraninių b altymų buvo sėkmingai ekspresuojami laisvose ląstelėse.
Kūrinių raiška
Gaminamas rekombinantinis b altymas CFP10-ESAT 6 ir naudojamas vakcinoms kurti. Toks tuberkuliozės alergenas leidžia sustiprinti imuninę sistemą ir sukurti antikūnus. Apskritai, molekuliniai tyrimai apima bet kurio b altymo aspekto, pvz., struktūros, funkcijos, modifikacijų, lokalizacijos ar sąveikos, tyrimą. IštyrinėtiKaip konkrečios medžiagos reguliuoja vidinius procesus, tyrėjams paprastai reikia priemonių, kad būtų galima sukurti įdomius ir naudingus funkcinius junginius.
Atsižvelgiant į b altymų dydį ir sudėtingumą, cheminė sintezė nėra tinkamas pasirinkimas šiam tikslui. Vietoj to, gyvos ląstelės ir jų ląstelinės mašinos paprastai naudojamos kaip gamyklos, kuriant ir konstruojant medžiagas pagal pateiktus genetinius šablonus. Tada rekombinantinio b altymo ekspresijos sistema sukuria reikiamą struktūrą vaistui sukurti. Toliau atrenkama įvairių kategorijų vaistams reikalinga medžiaga.
Skirtingai nei b altymus, DNR nesunku sukurti sintetiniu būdu arba in vitro naudojant nusistovėjusius rekombinantinius metodus. Todėl specifinių genų DNR šablonai su pridėtomis reporterių sekomis arba afiniteto žymenų sekomis arba be jų gali būti sukurti kaip stebimos medžiagos ekspresijos šablonai. Tokie junginiai, gauti iš tokių DNR šablonų, vadinami rekombinantiniais b altymais.
Tradicinės medžiagos ekspresijos strategijos apima ląstelių transfekavimą DNR vektoriumi, kuriame yra šablonas, ir tada ląstelių kultivavimą, kad būtų transkribuotas ir išverstas norimas b altymas. Paprastai ląstelės yra lizuojamos, kad būtų išgautas išreikštas junginys tolesniam gryninimui. Rekombinantinis b altymas CFP10-ESAT6 yra apdorojamas tokiu būdu ir praeina per valymo sistemą nuo galimotoksinų susidarymą. Tik po to jis bus sintetinamas į vakciną.
Plačiai naudojamos ir prokariotinės, ir eukariotinės molekulinių medžiagų ekspresijos sistemos in vivo. Sistemos pasirinkimas priklauso nuo b altymo rūšies, funkcinio aktyvumo poreikio ir norimo derlingumo. Šios ekspresijos sistemos apima žinduolius, vabzdžius, mieles, bakterijas, dumblius ir ląsteles. Kiekviena sistema turi savų pranašumų ir iššūkių, todėl norint, kad peržiūrima medžiaga būtų sėkminga, svarbu pasirinkti tinkamą sistemą konkrečiam naudojimui.
Žinduolių išraiška
Rekombinantinių b altymų naudojimas leidžia sukurti įvairaus lygio vakcinas ir vaistus. Tam gali būti naudojamas šis medžiagos gavimo būdas. Žinduolių ekspresijos sistemos gali būti naudojamos gaminant b altymus iš gyvūnų karalystės, kurie dėl savo fiziologiškai svarbios aplinkos turi natūraliausią struktūrą ir aktyvumą. Tai lemia aukštą potransliacinio apdorojimo ir funkcinės veiklos lygį. Žinduolių ekspresijos sistemos gali būti naudojamos gaminant antikūnus, sudėtingus b altymus ir junginius, skirtus naudoti ląstelių funkciniuose tyrimuose. Tačiau šie pranašumai siejami su griežtesnėmis auginimo sąlygomis.
Žinduolių ekspresijos sistemos gali būti naudojamos b altymams generuoti laikinai arba per stabilias ląstelių linijas, kuriose ekspresijos konstrukcija yra integruota į šeimininko genomą. Nors tokias sistemas galima naudoti keliuose eksperimentuose, laikasgamyba gali pagaminti didelį kiekį medžiagos per vieną ar dvi savaites. Šio tipo rekombinantinių b altymų biotechnologijos yra labai paklausios.
Šios trumpalaikės, didelio derlingumo žinduolių ekspresijos sistemos naudoja suspensines kultūras ir gali duoti gramų litre. Be to, palyginti su kitomis ekspresijos sistemomis, šie b altymai turi daugiau natūralių lankstymo ir potransliacinių modifikacijų, tokių kaip glikozilinimas.
Vabzdžių išraiška
Rekombinantinio b altymo gamybos metodai neapsiriboja žinduoliais. Yra ir produktyvesnių būdų gamybos sąnaudų požiūriu, nors medžiagos išeiga 1 litrui apdoroto skysčio yra daug mažesnė.
Vabzdžių ląstelės gali būti naudojamos ekspresuoti aukšto lygio b altymą su modifikacijomis, panašiomis į žinduolių sistemas. Yra keletas sistemų, kurios gali būti naudojamos generuoti rekombinantinį bakulovirusą, kuris vėliau gali būti naudojamas dominančios medžiagos ekstrahavimui iš vabzdžių ląstelių.
Rekombinantinių b altymų ekspresijos gali būti lengvai padidintos ir pritaikytos didelio tankio suspensijos kultūrai, kad būtų galima sujungti didelio masto molekules. Funkciškai jie yra labiau panašūs į natūralią žinduolių medžiagos sudėtį. Nors išeiga gali siekti iki 500 mg/l, rekombinantinio bakuloviruso gamyba gali užtrukti daug laiko, o auginimo sąlygos yra sunkesnės nei prokariotinės sistemos. Tačiau pietinėse ir šiltesnėse šalyse panašiaimetodas laikomas efektyvesniu.
Bakterijų ekspresija
Rekombinantinių b altymų gamybą galima nustatyti naudojant bakterijas. Ši technologija labai skiriasi nuo aukščiau aprašytų. Bakterijų b altymų ekspresijos sistemos yra populiarios, nes bakterijas lengva kultivuoti, jos greitai auga ir duoda didelį rekombinantinės kompozicijos derlių. Tačiau daugelio domenų eukariotinės medžiagos, ekspresuojamos bakterijose, dažnai neveikia, nes ląstelės nėra aprūpintos būtinomis modifikacijomis po transliacijos arba molekulinio lankstymo.
Be to, daugelis b altymų tampa netirpūs kaip inkliuzinės molekulės, kurias labai sunku atgauti be stiprių denatūratorių ir vėlesnių sudėtingų molekulinio perlankstymo procedūrų. Šis metodas dažniausiai laikomas vis dar eksperimentiniu.
Laisva raiška
Rekombinantinis b altymas, turintis stafilokinazės aminorūgščių seką, gaunamas šiek tiek kitokiu būdu. Jis įtrauktas į daugelio tipų injekcijas, todėl prieš naudojant reikia kelių sistemų.
B altymų ekspresija be ląstelių yra medžiagos sintezė in vitro, naudojant transliacijos požiūriu suderinamus visos ląstelės ekstraktus. Iš esmės visos ląstelės ekstraktuose yra visos makromolekulės ir komponentai, reikalingi transkripcijai, transliacijai ir net modifikacijoms po transliacijos.
Šie komponentai apima RNR polimerazę, reguliuojančius b altymų faktorius, transkripcijos formas, ribosomas ir tRNR. Pridedantkofaktorius, nukleotidus ir specifinį geno šabloną, šie ekstraktai gali susintetinti dominančius b altymus per kelias valandas.
Nors ir nėra tvarios didelio masto gamybai, be ląstelių arba b altymų ekspresijos in vitro (IVT) sistemos turi daug pranašumų, palyginti su įprastomis in vivo sistemomis.
Išraiška be ląstelių leidžia greitai sintezuoti rekombinantines kompozicijas nenaudojant ląstelių kultūros. Ląstelių neturinčios sistemos leidžia pažymėti b altymus modifikuotomis aminorūgštimis, taip pat ekspresuoti junginius, kuriuos greitai proteolitiškai skaido tarpląstelinės proteazės. Be to, tuo pačiu metu lengviau ekspresuoti daug skirtingų b altymų, naudojant metodą be ląstelių (pavyzdžiui, tiriant b altymų mutacijas mažos apimties ekspresija iš daugelio skirtingų rekombinantinių DNR šablonų). Šiame tipiniame eksperimente IVT sistema buvo naudojama žmogaus kaspazės-3 b altymui ekspresuoti.
Išvados ir ateities perspektyvos
Rekombinantinių b altymų gamybą dabar galima vertinti kaip brandžią discipliną. Tai yra daugybės laipsniško valymo ir analizės patobulinimų rezultatas. Šiuo metu vaistų atradimo programos retai sustabdomos dėl nesugebėjimo gaminti tikslinio b altymo. Daugelyje pasaulio laboratorijų dabar gerai žinomi lygiagretūs kelių rekombinantinių medžiagų ekspresijos, gryninimo ir analizės procesai.
B altymų kompleksai ir auganti sėkmė gaminantSolubilizuotos membranos struktūros turės atlikti daugiau pakeitimų, kad atitiktų paklausą. Veiksmingų sutartinių mokslinių tyrimų organizacijų atsiradimas dėl reguliaresnio b altymų tiekimo leis perskirstyti mokslinius išteklius, kad būtų galima įveikti šiuos naujus iššūkius.
Be to, lygiagrečios darbo eigos turėtų leisti sukurti visas stebimos medžiagos bibliotekas, kad būtų galima nustatyti naujus taikinius ir atlikti pažangią patikrą, kartu su tradiciniais mažų molekulių vaistų atradimo projektais.
