Šviesos sugertis ir tolesnis pakartotinis spinduliavimas neorganinėmis ir organinėmis terpėmis yra fosforescencijos arba fluorescencijos rezultatas. Skirtumas tarp reiškinių yra intervalo tarp šviesos sugerties ir srauto emisijos ilgis. Naudojant fluorescenciją, šie procesai vyksta beveik vienu metu, o su fosforescencija – su tam tikru vėlavimu.
Istorijos fonas
1852 m. britų mokslininkas Stoksas pirmą kartą aprašė fluorescenciją. Naują terminą jis sugalvojo atlikęs eksperimentus su fluoršpatu, kuris, veikiamas ultravioletinių spindulių, skleidė raudoną šviesą. Stoksas pastebėjo įdomų reiškinį. Jis nustatė, kad fluorescencinės šviesos bangos ilgis visada yra ilgesnis nei sužadinimo šviesos bangos ilgis.
19 amžiuje buvo atlikta daug eksperimentų hipotezei patvirtinti. Jie parodė, kad įvairūs mėginiai fluorescuoja veikiami ultravioletinių spindulių. Medžiagos, be kita ko, buvo kristalai, dervos, mineralai, chlorofilas,vaistinės žaliavos, neorganiniai junginiai, vitaminai, aliejai. Tiesiogiai dažai buvo pradėti naudoti biologinei analizei tik 1930 m.
Fluorescencinės mikroskopijos aprašymas
Kai kurios XX amžiaus pirmoje pusėje tyrimuose naudotos medžiagos buvo labai specifinės. Dėl rodiklių, kurių nepavyko pasiekti kontrastiniais metodais, fluorescencinės mikroskopijos metodas tapo svarbia priemone tiek biomedicininiuose, tiek biologiniuose tyrimuose. Gauti rezultatai buvo labai svarbūs medžiagų mokslui.
Kokie yra fluorescencinės mikroskopijos pranašumai? Naujų medžiagų pagalba tapo įmanoma išskirti labai specifines ląsteles ir submikroskopinius komponentus. Fluorescencinis mikroskopas leidžia aptikti atskiras molekules. Dažų įvairovė leidžia identifikuoti kelis elementus vienu metu. Nors įrangos erdvinę skiriamąją gebą riboja difrakcijos riba, kuri, savo ruožtu, priklauso nuo konkrečių mėginio savybių, molekulių aptikimas žemiau šio lygio taip pat yra visiškai įmanomas. Įvairūs mėginiai po švitinimo pasižymi autofluorescencija. Šis reiškinys plačiai naudojamas petrologijos, botanikos, puslaidininkių pramonėje.
Funkcijos
Gyvūnų audinių arba patogeninių mikroorganizmų tyrimą dažnai apsunkina per silpna arba labai stipri nespecifinė autofluorescencija. Tačiau vertė inmoksliniai tyrimai įgyja į medžiagą komponentų, sužadintų tam tikru bangos ilgiu ir skleidžiančių reikiamo intensyvumo šviesos srautą. Fluorochromai veikia kaip dažikliai, galintys savaime prisitvirtinti prie struktūrų (nematomų arba matomų). Tuo pačiu metu jie išsiskiria dideliu selektyvumu, atsižvelgiant į taikinius ir kvantinį derlių.
Fluorescencinė mikroskopija plačiai naudojama atsiradus natūraliems ir sintetiniams dažams. Jie turėjo specifinį emisijos ir sužadinimo intensyvumo profilį ir buvo nukreipti į konkrečius biologinius taikinius.
Atskirų molekulių identifikavimas
Dažnai idealiomis sąlygomis galite užregistruoti vieno elemento švytėjimą. Tam, be kita ko, būtina užtikrinti pakankamai žemą detektoriaus triukšmą ir optinį foną. Fluoresceino molekulė gali išspinduliuoti iki 300 000 fotonų iki sunaikinimo dėl fotobalinimo. Su 20% surinkimo greičiu ir proceso efektyvumu jų galima užregistruoti apie 60 tūkst.
Fluorescencinė mikroskopija, pagrįsta lavinų fotodiodais arba elektronų dauginimu, leido tyrėjams stebėti atskirų molekulių elgesį kelias sekundes, o kai kuriais atvejais ir minutes.
Sunkumai
Pagrindinė problema yra optinio fono triukšmo slopinimas. Kadangi daugelis filtrų ir lęšių konstrukcijoje naudojamų medžiagų turi tam tikrą autofluorescenciją, pradiniame etape mokslininkų pastangos buvo sutelktos įkomponentai su maža fluorescencija. Tačiau vėlesni eksperimentai atvedė prie naujų išvadų. Visų pirma buvo nustatyta, kad fluorescencinė mikroskopija, pagrįsta visu vidiniu atspindžiu, leidžia pasiekti žemą fono ir didelę sužadinimo šviesos išeigą.
Mechanizmas
Fluorescencinės mikroskopijos, pagrįstos visu vidiniu atspindžiu, principai yra naudoti greitai nykstančią arba neplintančią bangą. Jis atsiranda sąsajoje tarp terpių su skirtingais lūžio rodikliais. Šiuo atveju šviesos spindulys praeina per prizmę. Jis turi aukštą lūžio rodiklį.
Prizmė yra šalia vandeninio tirpalo arba mažų parametrų stiklo. Jei šviesos spindulys nukreipiamas į jį kampu, kuris yra didesnis už kritinį, spindulys visiškai atsispindi nuo sąsajos. Šis reiškinys savo ruožtu sukelia neplintančią bangą. Kitaip tariant, sukuriamas elektromagnetinis laukas, kuris prasiskverbia į žemesnio lūžio rodiklio terpę mažesniu nei 200 nanometrų atstumu.
Neplintančioje bangoje šviesos intensyvumo visiškai pakaks fluoroforams sužadinti. Tačiau dėl ypač mažo gylio jo tūris bus labai mažas. Rezultatas yra žemo lygio fonas.
Modifikacija
Fluorescencinė mikroskopija, pagrįsta visu vidiniu atspindžiu, gali būti atliekama naudojant epi-apšvietimą. Tam reikalingi objektyvai su padidinta skaitine diafragma (bent 1,4, bet pageidautina, kad ji siektų 1,45-1,6), taip pat iš dalies apšviestas aparato laukas. Pastarasis pasiekiamas naudojant mažą vietą. Siekiant didesnio vienodumo, naudojamas plonas žiedas, per kurį blokuojama dalis srauto. Norint pasiekti kritinį kampą, po kurio atsiranda visiškas atspindys, būtinas didelis panardinimo terpės lūžio lygis lęšiuose ir mikroskopo dangtelio stikle.
