Molekulinių biologinių tyrimų metodai vaidina didelį vaidmenį šiuolaikinėje medicinoje, kriminalistikoje ir biologijoje. DNR ir RNR tyrimų pažangos dėka žmogus gali ištirti organizmo genomą, nustatyti ligos sukėlėją, atpažinti norimą nukleorūgštį rūgščių mišinyje ir kt.
Molekulinių biologinių tyrimų metodai. Kas tai?
Aštuntajame ir devintajame dešimtmečiuose mokslininkams pirmą kartą pavyko iššifruoti žmogaus genomą. Šis įvykis davė impulsą genų inžinerijos ir molekulinės biologijos plėtrai. DNR ir RNR savybių tyrimas atvedė prie to, kad dabar šias nukleino rūgštis galima naudoti diagnozuojant ligą, tiriant genus.
DNR ir RNR gavimas
Molekulinės biologinės diagnostikos metodai reikalauja pradinės medžiagos: dažniau tai yra nukleino rūgštys. Yra keletas būdų, kaip šias medžiagas išskirti iš gyvų organizmų ląstelių. Kiekvienas iš jų turi savų privalumų ir trūkumų, ir tai yra būtinaį tai atsižvelkite rinkdamiesi grynų nukleorūgščių išskyrimo metodą.
1. DNR gavimas pagal Marmur. Metodas susideda iš medžiagų mišinio apdorojimo alkoholiu, dėl kurio nusėda gryna DNR. Šio metodo trūkumas yra agresyvių medžiagų: fenolio ir chloroformo naudojimas.
2. DNR išskyrimas pagal Boom. Pagrindinė čia naudojama medžiaga yra guanidino tiocianatas (GuSCN). Jis prisideda prie dezoksiribonukleino rūgšties nusodinimo ant specializuotų substratų, iš kurių vėliau ją galima surinkti naudojant specialų buferį. Tačiau GuSCN yra PTC inhibitorius, ir net nedidelė jo dalis, patenkanti į nusodintą DNR, gali paveikti polimerazės grandininės reakcijos, kuri atlieka svarbų vaidmenį dirbant su nukleino rūgštimis, eigą.
3. Priemaišų nusėdimas. Metodas nuo ankstesnių skiriasi tuo, kad nusodinamos ne dezoksiribonukleino rūgšties molekulės, o priemaišos. Tam naudojami jonų keitikliai. Trūkumas yra tas, kad ne visos medžiagos gali nusodinti.
4. Masinis atranka. Šis metodas naudojamas tais atvejais, kai nereikia tikslios informacijos apie DNR molekulės sudėtį, tačiau būtina gauti kai kuriuos statistinius duomenis. Tai paaiškinama tuo, kad apdorojant plovikliais, ypač šarmais, nukleino rūgšties struktūra gali būti pažeista.
Tyrimo metodų klasifikacija
Visi molekulinių biologinių tyrimų metodai skirstomi į tris dideles grupes:
1. Amplifikacija (naudojant daug fermentų). čiareiškia PGR – polimerazės grandininę reakciją, kuri atlieka svarbų vaidmenį daugelyje diagnostikos metodų.
2. Nestiprinantis. Ši metodų grupė yra tiesiogiai susijusi su nukleorūgščių mišinių veikimu. Pavyzdžiai: 3 blotai, hibridizacija in situ ir kt.
3. Metodai, pagrįsti signalo iš zondo molekulės, kuri jungiasi su specifine zondo DNR arba RNR, atpažinimu. Pavyzdys yra hibridinė fiksavimo sistema (hc2).
Fermentai, kuriuos galima naudoti molekulinės biologijos tyrimų metoduose
Daugelis molekulinės diagnostikos metodų apima įvairių fermentų naudojimą. Toliau pateikiami dažniausiai naudojami:
1. Restrikcijos fermentas – „supjausto“DNR molekulę į reikiamas dalis.
2. DNR polimerazė – sintetina dvigrandę dezoksiribonukleino rūgšties molekulę.
3. Atvirkštinė transkriptazė (revertazė) – naudojama DNR sintezei RNR šablone.
4. DNR ligazė – atsakinga už fosfodiesterio ryšių tarp nukleotidų susidarymą.
5. Egzonukleazė – pašalina nukleotidus iš galinių dezoksiribonukleorūgšties molekulės dalių.
PGR yra pagrindinis DNR amplifikacijos metodas
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) aktyviai naudojama šiuolaikinėje molekulinėje biologijoje. Tai metodas, kai iš vienos DNR molekulės galima gauti daugybę kopijų (molekulės amplifikuojamos).
Pagrindinės PGR funkcijos:
- diagnostikaligos;
- DNR segmentų, genų klonavimas.
Polimerazės grandininei reakcijai atlikti reikalingi šie elementai: pradinė DNR molekulė, termostabili DNR polimerazė (Taq arba Pfu), dezoksiribonukleotido fosfatai (azoto bazių š altiniai), pradmenys (2 pradmenys 1 DNR molekulėje) ir pati buferinė sistema, kurioje galimos visos reakcijos.
PGR susideda iš trijų etapų: denatūravimo, pradmenų atkaitinimo ir pailginimo.
1. Denatūravimas. Esant 94-95 laipsnių Celsijaus temperatūrai, vandeniliniai ryšiai tarp dviejų DNR grandžių nutrūksta, todėl gauname dvi vienagrandes molekules.
2. Grunto atkaitinimas. Esant 50–60 laipsnių Celsijaus temperatūrai, pradmenys yra pritvirtinami prie viengrandžių nukleorūgščių molekulių galų pagal komplementarumo tipą.
3. Pailgėjimas. Esant 72 laipsnių temperatūrai, vyksta dukterinių dvigrandžių dezoksiribonukleino rūgšties molekulių sintezė.
DNR sekos nustatymas
Molekulinių biologinių tyrimų metodai dažnai reikalauja žinių apie nukleotidų seką dezoksiribonukleorūgšties molekulėje. Siekiant nustatyti genetinį kodą, atliekama seka. Ateities molekulinė diagnostika bus pagrįsta žiniomis, gautomis iš žmogaus sekos nustatymo.
Išskiriami šie sekos tipai:
- Maxamo-Gilberto seka;
- Sangerio seka;
- pirosekvenavimas;
- nanoporasseka.
