Kas yra DNR hibridizacijos pagrindas? Nors dvigrandė DNR seka paprastai yra stabili fiziologinėmis sąlygomis, pakeitus šias sąlygas laboratorijoje (paprastai pakėlus aplinkos temperatūrą), molekulės išsiskirs į atskiras grandines. Pastarosios viena kitą papildo, bet gali papildyti ir kitas jų aplinkoje esančias sekas. Aplinkos temperatūros sumažinimas leidžia viengrandėms molekulėms susilieti arba „hibridizuotis“viena su kita. Tai yra DNR hibridizacijos metodas.
Sąvoka molekulinės biologijos požiūriu
Mokslininkai, užsiimantys DNR replikacija ir DNR transkripcija į RNR, remiasi nukleotidų kryžminimo ir molekulinės biologijos metodais. Tai apima Southern ir Northern blot, polimerazės grandininę reakciją (PGR) ir daugumą DNR-RNR hibridizacijos ir sekos nustatymo metodų.
Programa
Hibridizacija yra pagrindinė nukleotido savybėsekas ir yra naudojamas daugelyje molekulinės biologijos metodų. Bendras dviejų rūšių genetinis ryšys gali būti nustatytas hibridizuojant jų DNR segmentus (DNR-DNR hibridizacija). Dėl glaudžiai giminingų organizmų sekų panašumų, tokiems DNR hibridams ištirpti reikalinga aukštesnė temperatūra, palyginti su tolimesniais organizmais. DNR mėginio kilmei nustatyti naudojama hibridizacija, įskaitant polimerazės grandininę reakciją (PGR). Kitu metodu trumpos DNR sekos hibridizuojamos su ląstelių mRNR, kad būtų nustatyti ekspresuoti genai. Farmacijos įmonės tiria antisensinės RNR naudojimą, kad prisijungtų prie nepageidaujamos mRNR, neleidžiant ribosomai paversti mRNR į b altymą.
DNR-DNR hibridizacija paprastai reiškia molekulinės biologijos metodą, kuris matuoja genetinio panašumo laipsnį tarp DNR sekų telkinių. Jis dažniausiai naudojamas genetiniam atstumui tarp dviejų organizmų nustatyti. Jis buvo plačiai naudojamas filogenijoje ir taksonomijoje.
Metodika
Vieno organizmo DNR buvo paženklinta, tada sumaišyta su nepažymėta DNR, kurią būtų galima palyginti su ja. Mišinys inkubuojamas, kad DNR grandinės atsiskirtų, o po to atvėsinamas, kad susidarytų regeneruota hibridinė dvigrandė DNR. Hibridizuotos sekos, turinčios didelį panašumą, susiriš tvirčiau ir jas atskirti prireiks daugiau energijos: t. y. jos atsiskiria, kai kaitinamos aukštesnėje temperatūroje.temperatūra nei skirtingos sekos, procesas žinomas kaip „DNR lydymas“.
DNR tirpsta
Vertinant hibridizuotos DNR lydymosi profilį, dvigrandė DNR sujungiama su vadinamąja „kolonėle“, o gautas mišinys kaitinamas. Kiekviename etape kolonėlė nuplaunama, o DNR sekos, kurios išsilydo, tampa viengrandžiais ir nuplaunamos iš kolonėlės. Temperatūra, kurioje pažymėta DNR išeina iš kolonėlės, atspindi sekų panašumą (o savaime susilankstantis modelis yra kontrolė). Šie rezultatai sujungiami siekiant nustatyti genetinio panašumo tarp organizmų laipsnį. Remiantis šiuolaikine mikrobiologija, DNR hibridizacija neįmanoma nesuvokus šių dalykų.
Kai tokiu būdu lyginamos kelios ribonukleino rūgšties (arba dezoksiribonukleino) rūgšties rūšys, panašumo reikšmės leidžia rūšį įtraukti į filogenetinį medį. Todėl tai yra vienas iš galimų molekulinės sistemos metodų. Charlesas Sibley ir Johnas Ahlquistas, šios technikos pradininkai, naudojo DNR ir DNR hibridizaciją paukščių (Sibley-Ahlquist taksonomija) ir primatų filogenetiniams ryšiams tirti.
Svarba biologijai
DNR-DNR hibridizacija yra auksinis bakterijų rūšių atskyrimo standartas, kurio panašumo vertė yra didesnė nei 70%, o tai rodo, kad lyginamos padermės priklauso skirtingoms rūšims. 2014 m. buvo pasiūlyta 79 % panašumo riba atskiriant bakterijų porūšį.
Kritai tvirtina, kad šis metodas yra netikslus lyginant artimai susijusias rūšis, nes bet koks bandymas išmatuoti ortologinių organizmų sekų skirtumus yra priblokštas dėl paraloginių atitikmenų hibridizacijos organizmo genome. Šiuo metu dažniausiai naudojamas genetinio atstumo nustatymo metodas yra DNR sekos nustatymas ir skaičiavimo sekų palyginimas, nors šis metodas vis dar naudojamas mikrobiologijoje, siekiant padėti nustatyti bakterijas.
Dabartinis būdas yra atlikti DNR ir DNR hibridizaciją silikone, naudojant visiškai arba iš dalies sekvenuotus genomus. DSMZ sukurtas GGDC yra tiksliausias žinomas įrankis DDH panašioms reikšmėms apskaičiuoti. Be kitų algoritminių patobulinimų, jis išsprendžia paraloginių sekų problemą, atidžiai jas išfiltruodamas iš dviejų genomo sekų atitikčių.
FISH metodas
Fluorescencinė hibridizacija in situ (FISH) yra laboratorinis metodas, naudojamas aptikti ir sekti DNR, dažnai tam tikroje chromosomoje.
1969 m. Josephas Gall ir Mary Lou Pardu paskelbė dokumentą, įrodantį, kad radioaktyviosios ribosominės DNR sekos kopijos gali būti naudojamos norint aptikti papildomas DNR sekas varlės kiaušinio branduolyje. Nuo šių pirminių stebėjimų daugelis patobulinimų padidino universalumą irprocedūros jautrumas iki tokio lygio, kad in situ hibridizacija („in vietoje“, lot.) dabar laikoma svarbia citogenetikos priemone. (Sąvoka in situ dabar taip pat vartojama kalbant apie pradinę karcinomos augimo stadiją, kai patologiniame procese dalyvauja tik epitelio audinys.)
Fluorescencinė hibridizacijos seka
RNR zondai gali būti sukurti bet kuriam genui arba bet kokiai geno sekai, kad būtų galima vizualizuoti lncRNR ir miRNR mRNR audiniuose ir ląstelėse. FISH naudojamas tiriant ląstelių dauginimosi ciklą, ypač branduolinę tarpfazę, siekiant nustatyti bet kokius chromosomų anomalijas. FISH leidžia analizuoti daugybę archyvinių bylų, daug lengviau nustatyti identifikuotą chromosomą sukuriant zondą su dirbtine chromosomų baze, kuri pritrauks panašias chromosomas.
Hibridizacijos signalai kiekvienam zondui, kai aptinkama branduolio anomalija: kiekvienas mRNR ir lncRNR aptikimo zondas susideda iš 20 porų oligonukleotidų, kiekviena pora apima 40-50 bp erdvę. p. Zondai mRNR aptikti naudoja patentuotą chemiją.
Hibridizacija su DNR zondais
Zondai dažnai gaminami iš DNR fragmentų, kurie buvo išskirti, išgryninti ir amplifikuoti, kad būtų galima naudoti kuriant žmogaus genomą. Žmogaus genomo dydis yra toks didelis, palyginti su ilgiu, kurį galima tiesiogiai sekvenuoti, kad jį reikia padalyti įfragmentai. Galiausiai šie fragmentai buvo suskirstyti suskaidant kiekvieno fragmento kopiją į dar mažesnius vienetus, naudojant sekai specifines endonukleazes, siekiant išmatuoti kiekvieno mažo fragmento dydį naudojant dydžio išskyrimo chromatografiją, naudojant šią informaciją, siekiant nustatyti, kur dideli fragmentai sutampa vienas su kitu.
Siekiant išsaugoti elementus su jų individualiomis DNR sekomis, fragmentai buvo įtraukti į nuolat besikartojančių bakterijų populiacijų sistemą. Kloninės bakterijų populiacijos, kurių kiekviena išlaiko vieną dirbtinę chromosomą, yra saugomos įvairiose laboratorijose visame pasaulyje. Dirbtinės chromosomos (BAC) gali būti auginamos, ekstrahuojamos ir ženklinamos bet kurioje laboratorijoje, kurioje yra biblioteka. Genominės bibliotekos dažnai vadinamos institucijų, kuriose jos buvo sukurtos, vardu. Pavyzdys yra RPCI-11 biblioteka, pavadinta Roswell Cancer Institute Bafale (Niujorkas, JAV) vardu. Šie fragmentai sudaro apie 100 tūkstančių bazinių porų ir yra daugumos FISH zondų pagrindas.
