Šiuolaikinė biologija stebina savo atradimų unikalumu ir mastu. Šiandien šis mokslas tiria daugumą procesų, kurie yra paslėpti nuo mūsų akių. Tai ypač svarbu molekulinei biologijai – vienai iš perspektyvių sričių, padedančių atskleisti sudėtingiausias gyvosios medžiagos paslaptis.
Kas yra atvirkštinė transkripcija
Atvirkštinė transkripcija (sutrumpintai RT) yra specifinis procesas, būdingas daugumai RNR virusų. Pagrindinis jo bruožas yra dvigrandės DNR molekulės, pagrįstos pasiuntinio RNR, sintezė.
OT nėra būdingas bakterijoms ar eukariotiniams organizmams. Pagrindinis fermentas, reversetazė, atlieka pagrindinį vaidmenį dvigrandės DNR sintezėje.
Atradimų istorija
Idėja, kad ribonukleorūgšties molekulė galėtų tapti DNR sintezės šablonu, buvo laikoma absurdiška iki aštuntojo dešimtmečio. Tada B altimorė ir Teminas, dirbdami atskirai vienas nuo kito, beveik vienu metu atrado naują fermentą. Jie tai pavadino nuo RNR priklausoma DNR polimeraze arba atvirkštine transkriptaze.
Šio fermento atradimas besąlygiškai patvirtino organizmų egzistavimągalintis atlikti atvirkštinę transkripciją. Abu mokslininkai 1975 metais gavo Nobelio premiją. Po kurio laiko Engelhardtas pasiūlė alternatyvų atvirkštinės transkriptazės pavadinimą – revertazė.
Kodėl OT prieštarauja pagrindinei molekulinės biologijos dogmai
Centrinė dogma yra nuoseklios b altymų sintezės bet kurioje gyvoje ląstelėje koncepcija. Tokia schema sudaryta iš trijų komponentų: DNR, RNR ir b altymų.
Pagal centrinę dogmą, RNR gali būti sintezuojama tik DNR šablone ir tik tada RNR dalyvauja kuriant pirminę b altymo struktūrą.
Ši dogma buvo oficialiai priimta mokslo bendruomenėje prieš atrandant atvirkštinę transkripciją. Nenuostabu, kad atvirkštinės DNR sintezės iš RNR idėją mokslininkai jau seniai atmetė. Tik 1970 m., atradus reversetazę, ši problema buvo baigta, o tai atsispindėjo b altymų sintezės koncepcijoje.
Paukščių retrovirusų atstatymas
Atvirkštinės transkripcijos procesas nėra baigtas be nuo RNR priklausomos DNR polimerazės dalyvavimo. Paukščių retroviruso revertazė iki šiol buvo ištirta maksimaliai.
Viename šios virusų šeimos virione galima rasti tik apie 40 šio b altymo molekulių. B altymas susideda iš dviejų vienodo skaičiaus subvienetų ir atlieka tris svarbias atvirkštinio atkūrimo funkcijas:
1) DNR molekulės sintezė tiek ant viengrandžių/dvigrandžių RNR šablonų, tiek remiantis dezoksiribonukleino rūgštimis.
2) RNazės H aktyvinimas, kurio pagrindinis vaidmuo yraRNR molekulės skilimas RNR-DNR komplekse.
3) DNR molekulių sekcijų, skirtų įterpti į eukariotų genomą, sunaikinimas.
Mechanizmas OT
Atvirkštinės transkripcijos žingsniai gali skirtis priklausomai nuo virusų šeimos, t.y. apie jų nukleorūgščių tipą.
Pirmiausia panagrinėkime tuos virusus, kurie naudoja reversetazę. Čia OT procesas yra padalintas į 3 veiksmus:
1) „-“RNR grandinės sintezė RNR grandinės šablone „+“.
2) RNR „+“grandinės sunaikinimas RNR-DNR komplekse naudojant fermentą RNazę H.
3) Dvigrandės DNR molekulės sintezė RNR grandinės šablone „-“.
Šis virionų dauginimosi būdas būdingas kai kuriems onkogeniniams virusams ir žmogaus imunodeficito virusui (ŽIV).
Verta pažymėti, kad bet kurios nukleino rūgšties sintezei RNR šablone reikalinga sėkla arba pradmenys. Pradmenys yra trumpa nukleotidų seka, kuri papildo RNR molekulės (šablono) 3' galą ir atlieka svarbų vaidmenį inicijuojant sintezę.
Kai paruoštos dvigrandės virusinės kilmės DNR molekulės integruojamos į eukariotų genomą, prasideda įprastas viriono b altymų sintezės mechanizmas. Dėl to viruso „pagauta“ląstelė tampa virionų gamybos gamykla, kurioje dideliais kiekiais susidaro reikalingos b altymų ir RNR molekulės.
Kitas atvirkštinės transkripcijos būdas yra pagrįstas RNR sintetazės veikimu. Šis b altymas yra aktyvus paramiksovirusuose, rabdovirusuose, pikornovirusuose. Šiuo atveju nėra trečiojo OT etapo – formavimosidvigrandė DNR, o vietoj to virusinės „-“RNR grandinės šablone sintetinama „+“RNR grandinė ir atvirkščiai.
Tokių ciklų kartojimas lemia ir viruso genomo replikaciją, ir mRNR, galinčios sintezuoti b altymus užkrėstos eukariotinės ląstelės sąlygomis, susidarymą.
Biologinė atvirkštinės transkripcijos reikšmė
OT procesas yra nepaprastai svarbus daugelio virusų (pirmiausia retrovirusų, tokių kaip ŽIV) gyvavimo cikle. Viriono, užpuolusio eukariotinę ląstelę, RNR tampa pirmosios DNR grandinės sintezės šablonu, ant kurio nesunku užbaigti antrąją grandinę.
Gauta dvigrandė viruso DNR integruojama į eukariotų genomą, dėl to suaktyvėja viriono b altymų sintezės procesai ir užkrėstoje ląstelėje atsiranda daug jo kopijų. Tai yra pagrindinė Revertase ir apskritai OT misija virusui.
Atvirkštinė transkripcija taip pat gali vykti eukariotuose retrotranspozonų – mobiliųjų genetinių elementų, galinčių savarankiškai perkelti iš vienos genomo dalies į kitą – kontekste. Tokie elementai, pasak mokslininkų, sukėlė gyvų organizmų evoliuciją.
Retrotransposonas yra eukariotinės DNR atkarpa, koduojanti kelis b altymus. Viena iš jų, reversetazė, yra tiesiogiai susijusi su tokio retrotransporozono delokalizavimu.
OT naudojimas moksle
Nuo to momento, kai reversetazė buvo išskirta gryna forma, atvirkštinės transkripcijos procesą priėmė biologai. OT mechanizmo tyrimas vis dar padeda nuskaityti svarbiausių žmogaus b altymų sekas.
Faktas yra tas, kad eukariotų, įskaitant mus, genome yra neinformatyvių sričių, vadinamų intronais. Kai iš tokios DNR nuskaitoma nukleotidų seka ir susidaro vienagrandė RNR, pastaroji praranda intronus ir koduoja išskirtinai b altymą. Jei DNR sintezuojama naudojant reversetazę RNR šablone, nesunku nustatyti jos seką ir sužinoti nukleotidų tvarką.
Nukleino rūgštis, susidariusi veikiant atvirkštinei transkriptazei, vadinama kDNR. Jis dažnai naudojamas polimerazės grandininėje reakcijoje (PGR), siekiant dirbtinai padidinti gautos cDNR kopijos kopijų skaičių. Šis metodas taikomas ne tik moksle, bet ir medicinoje: laborantai iš bendros bibliotekos nustato tokios DNR panašumą su įvairių bakterijų ar virusų genomais. Vektorių sintezė ir jų patekimas į bakterijas yra viena iš perspektyvių biologijos sričių. Jei RT naudojamas formuoti žmonių ir kitų organizmų DNR be intronų, tokios molekulės gali būti lengvai įvestos į bakterijų genomą. Taigi pastarieji tampa gamyklomis, gaminančiomis žmogui reikalingas medžiagas (pavyzdžiui, fermentus).
