Audinių kultūros metodas yra vienas pagrindinių šiuolaikinės biotechnologijos įrankių, leidžiantis spręsti praktines augalų fiziologijos, biochemijos ir genetikos problemas. Dirbtinis medžiagos auginimas atliekamas laikantis tam tikrų sąlygų: sterilizavimo, temperatūros kontrolės ir specialios maistinės terpės poveikio.
Essence
Audinių kultūros metodas yra jų ilgalaikis konservavimas ir (arba) dirbtinis auginimas laboratorinėmis sąlygomis maistinėje terpėje. Ši technologija leidžia sukurti biologinį modelį, skirtą įvairiems procesams ląstelėse, kurios egzistuoja už augalų, žmonių ir gyvūnų kūno ribų, tirti.
Augalų audinių kultūros dauginimasis grindžiamas totipotencijos savybe – ląstelių gebėjimu išsivystyti į vientisą organizmą. Gyvūnams tai realizuojama tik apvaisintuose kiaušinėliuose (išskyrus kai kurių rūšių koelenteratus).
Plėtros istorija
Pirmieji bandymai kultivuoti augalų audinius buvo atlikti vokiečių mokslininkų XIX–XX amžių sandūroje. Nepaisant to, kad jos buvo nesėkmingos, buvo suformuluota nemažai idėjų, kurios vėliau pasitvirtino.
1922 m. W. Robbinsas ir W. Kotte, nepriklausomai vienas nuo kito, sugebėjo auginti kukurūzų ir pomidorų šaknų galiukus dirbtinėje maistinėje terpėje. Išsamus ląstelių ir audinių kultūros metodų tyrimas buvo pradėtas praėjusio amžiaus ketvirtajame dešimtmetyje. 20 amžiaus R. Gautre ir F. White įrodė, kad periodiškai persodinant audinių kultūras į šviežią maistinę terpę, jos gali augti neribotą laiką.
Iki 1959 m. laboratorinėmis sąlygomis buvo auginamos 142 augalų rūšys. XX amžiaus antroje pusėje. taip pat pradėtos naudoti išsklaidytos (atskirtos) ląstelės.
Bandomosios medžiagos tipai
Yra 2 pagrindiniai augalų audinių kultūrų tipai:
- Pagaminta nesunaikinant ir išsaugant būdingus gyvam organizmui būdingus bruožus.
- Išskirtas skaidant (cheminiu, fermentiniu ar mechaniniu) iš pirminio audinio. Gali būti suformuotas iš vienos ar kelių ląstelių kultūrų.
Pagal auginimo būdą išskiriami šie metodai:
- ant „maitinimo sluoksnio“, kuriame besidalijančios tos pačios augalų rūšies ląstelės išskiria audinių augimą skatinančią medžiagą;
- naudojant slaugytojo audinį šalia kultivuotų ląstelių;
- izoliuotos besidalijančios ląstelių grupės maistinės terpės naudojimas;
- auginti atskiras pavienes ląsteles kompozicijos prisotintame mikrolašelyje.
Auginimas iš pavienių ląstelių yra kupinas tam tikrų sunkumų. Kad dirbtinai „priverstų“juos dalytis, jie turi gauti signalą iš kaimyninių, aktyviai veikiančių ląstelių.
Vienas iš pagrindinių audinių tipų fiziologiniams tyrimams yra nuospauda, atsirandanti veikiant nepalankiems išoriniams veiksniams (dažniausiai mechaniniams pažeidimams). Jie turi galimybę prarasti specifines pirminiam audiniui būdingas savybes. Dėl to kalio ląstelės pradeda aktyviai dalytis ir susidaro augalo dalys.
Būtinos sąlygos
Audinių ir ląstelių kultūros metodo sėkmė priklauso nuo šių veiksnių:
- Atitikimas sterilumui. Transplantacijai naudojamos specialios dėžės su išvalytu oru, aprūpintos ultravioletinėmis lempomis. Įrankius ir medžiagas, drabužius ir personalo rankas reikia apdoroti aseptiškai.
- Specialiai parinktų maistinių medžiagų, turinčių anglies ir energijos š altinių (dažniausiai sacharozės ir gliukozės), mikro ir makroelementų, augimo reguliatorių (auksinų, citokininų), vitaminų (tiamino, riboflavino, askorbo ir pantoteno rūgšties ir kt.), naudojimas.).
- Atitiktis temperatūrai (18-30 °C), apšvietimo sąlygoms ir drėgmei (60-70%). Dauguma kalio audinių kultūrų auginamos aplinkos šviesoje, nes jose nėra chloroplastų, tačiau kai kuriems augalams reikalingas foninis apšvietimas.
Šiuo metu paruoštakomercinės grupės (Murasige ir Skoog, Gamborg ir Eveleg, White, Kao ir Mikhailyuk ir kt.).
Pliusai ir trūkumai
Ląstelių ir audinių kultūros metodo pranašumai yra šie:
- geras gautų rezultatų atkuriamumas;
- tarpląstelinės sąveikos reguliavimas;
- mažas reagentų suvartojimas;
- ląstelių linijų genetinis homogeniškumas;
- auginimo proceso mechanizavimo galimybė;
- narvo sąlygų kontrolė;
- gyvų kultūrų laikymas žemoje temperatūroje.
Šios biotechnologijos trūkumas yra:
- reikia laikytis griežtų aseptikos sąlygų;
- ląstelių savybių nestabilumas ir jų nepageidaujamo maišymosi galimybė;
- didelė cheminių medžiagų kaina;
- nevisiškas gyvame organizme auginamų audinių ir ląstelių lygiavertiškumas.
Programa
Tyrimui naudojamas audinių kultūros metodas:
- procesai ląstelių viduje (DNR, RNR ir b altymų sintezė, medžiagų apykaita ir įtaka jai vaistų pagalba);
- tarpląstelinės reakcijos (medžiagų patekimas per ląstelių membranas, hormonų-receptorių komplekso darbas, ląstelių gebėjimas sukibti viena su kita, histologinių struktūrų susidarymas);
- sąveika su aplinka (maistinių medžiagų įsisavinimas, infekcijų perdavimas, kilmės ir vystymosi procesainavikai ir kiti);
- genetinių manipuliacijų su ląstelėmis rezultatai.
Perspektyvios biologijos ir farmakologijos sritys, kurioms kuriant naudojama ši technologija, yra:
- veiksmingų herbicidų, agronominių augalų augimo reguliatorių, biologiškai aktyvių junginių, skirtų naudoti vaistams gaminti (alkaloidai, steroidai ir kt.), gavimas;
- orientuota mutagenezė, naujų hibridų veisimas, postgaminio nesuderinamumo įveikimas;
- kloninis dauginimas, leidžiantis gauti daug genetiškai identiškų augalų;
- virusams atsparių ir neužkrėstų augalų veisimas;
- genų fondo kriokonservavimas;
- audinių rekonstrukcija, kamieninių ląstelių š altinių kūrimas (audinių inžinerija).
