Bakterijų auginimas: metodai, principai, žingsniai ir sąlygos

2024 Autorius: Angel Austin | [email protected]. Paskutinį kartą keistas: 2023-12-17 05:34

Mikroorganizmai mus supančioje gamtoje yra visur: dirvose, vandens telkiniuose, įvairių objektų paviršiuose jais gyvena žmonės ir gyvūnai. Visa tai gali būti maisto, vaistų ir gamybos linijų mikrobinės taršos š altiniai. Bakterijų auginimas yra būtinas norint ištirti jų savybes, poreikius ir savybes. Tai, savo ruožtu, yra svarbus žingsnis kuriant įvairius vaistus, atliekant laboratorinę ligų diagnostiką, apskaičiuojant gamybos reaktorius ir dar daugiau.

Bendrosios sąvokos

Bakterijų auginimas mikrobiologijoje reiškia mikroorganizmų auginimą laboratorijoje. Savo ruožtu mikrobai, išaugę ant pasirinktos maistinės terpės, vadinami kultūra. Kultūros gali būti maišomos, jei jas sudaro skirtingų tipų mikroorganizmai, ir grynos, jei joms atstovauja tik vienos rūšies bakterijos.

Jei maistingasĮ terpę dedama tik viena ląstelė, o jos dauginimosi rezultatu gaunama individų grupė, tada šis mikroorganizmų rinkinys vadinamas klonu. Kai klonas išsivysto tiek, kad jis tampa matomas plika akimi, ši bakterijų kolekcija vadinama kolonija.

Paprastai bakterijos, išskirtos iš skirtingų š altinių, auginamos atskirai viena nuo kitos. Kiekviena tokia atskirai auginama mikrobų grupė vadinama paderme. Taigi, jei vienas stafilokokų tipas yra išskirtas iš trijų š altinių (arba skirtingų to paties produkto dalių, skirtingų žmonių), jie kalba apie tris šio tipo stafilokokų padermes.

Bakterijų augimo veiksniai

Tai įvairios aminorūgštys, lipidai, purino bazės ir kiti junginiai, būtini mikroorganizmams vystytis. Kai kurie mikrobai gali savarankiškai gaminti jiems reikalingas medžiagas, o kiti turi gauti jas gatavu pavidalu. Atsižvelgiant į mikroorganizmų poreikius tam tikruose augimo faktoriuose, atliekamas bakterijų identifikavimas ir diferenciacija. Be to, šis parametras svarbus tinkamai paruošiant maistinę terpę laboratoriniams ir biotechnologiniams darbams:

• Amino rūgštys. Bakterijoms gali prireikti vienos konkrečios aminorūgšties arba rūgščių grupės. Taigi klostridijoms reikia leucino ir tirozino, streptokokams – leucino ir arginino. Mikroorganizmai, kuriems augti reikalingos aminorūgštys iš išorės, vadinami auksotrofais.
• Purino ir pirimidino bazės, taip pat jų dariniai (adeninas, guaninas ir kt.). Jie yra svarbus daugelio augimo veiksnysStreptococcus rūšys.
• Vitaminai. Jie yra kofermentų, reikalingų bakterijoms, dalis. Taigi, nikotino rūgštis, taip pat jos amidas, kurie yra NAD ir NADP dalis, reikalingi difterijos ir šigella corynebakterijoms. Tiamino, kaip neatskiriamos pirofosfato dalies, reikia Staphylococcus aureus, pneumokokams, brucelėms. Pantoteno rūgštis, kuri yra CoA kofermento dalis, reikalinga stabligės baciloms ir tam tikroms streptokokų rūšims. Citochromai, taigi juos formuojanti folio rūgštis, hemas ir biotinas yra būtini Mycobacterium tuberculosis ir Haemophilus influenzae.

Aplinkos reikalavimai

Sąlygos auginimo terpėms, skirtoms bakterijoms auginti:

1. Mityba. Juose turi būti medžiagų, be to, lengvai virškinama forma, reikalingų mikroorganizmams maitintis ir pasipildyti energija. Tai apima organogenus ir mineralus. Kai kuriems mikroorganizmams papildomai reikia vitaminų ir aminorūgščių, kurių jie negali susintetinti.
2. Optimalus pH lygis. Tai turi įtakos ląstelės membranos pralaidumui ir atitinkamai gebėjimui įsisavinti bakterijos maistines medžiagas. Dažniausiai pH vertė turėtų būti 7, 2–7, 4. Daugelis mikroorganizmų savo gyvenimo eigoje gamina produktus su rūgštinėmis ar šarminėmis reakcijomis, o kad maistinės terpės pH nesikeistų, jis turi būti buferinis.
3. Izotoninis. Osmosinis slėgis maistinėje terpėje, skirta bakterijoms auginti, turėtų būti tokia pati kaipmikrobų ląstelių viduje. Paprastai jis atitinka 0,5 % NaCl tirpalą.
4. Sterilumas. Taip yra dėl to, kad svetimų bakterijų atsiradimas iškraipys analizuojamos padermės tyrimo rezultatus.
5. Drėgmės lygis. Šis indikatorius kartu su terpės konsistencija turėtų turėti optimalias tam tikro tipo bakterijų savybes.
6. Redokso potencialas (RH2). Tai rodo medžiagų, kurios dovanoja ir priima elektronus, santykį, taip pat maistinės terpės deguonies prisotinimo lygį. Aerobams ir anaerobams bakterijų auginimo sąlygos šiuo rodikliu šiek tiek skiriasi. Anaerobiniai mikroorganizmai geriausiai dauginasi esant žemesnei nei 5 RH2 vertei, o aerobiniai mikroorganizmai – mažiausiai 10.
7. Vienodumas. Svarbu, kad auginimo terpėje būtų pastovus atskirų sudedamųjų dalių kiekis. Be to, pirmenybė teikiama skaidriems tirpalams, kurie padeda lengviau stebėti pasėlių augimą arba pastebėti užteršimą.

Kultūros terpės tipai

Konkrečios terpės mikroorganizmų auginimui pasirinkimą įtakoja daug veiksnių, tarp kurių yra jų mitybos ypatybės ir tyrimo tikslas. Pagrindinės maistinių terpių klasifikavimo savybės yra šios:

1. Komponentai. Pagal pradines medžiagas, naudojamas substratui sukurti, jos išskiria:

• natūralūs, kurie yra paruošti iš gyvūninės arba augalinės kilmės produktų (pvz., mėsos, pieno, vaisių) ir tinkami auginti mišriaipasėliai;
• pusiau sintetinis, kuriame brangūs natūralūs maisto produktai pakeičiami ne maisto produktais (pavyzdžiui, kaulų miltai, kraujo krešuliai) ir kurie yra optimalūs tam tikrų rūšių bakterijoms auginti arba jų medžiagų apykaitos produktams izoliuoti nuo aplinka;
• sintetiniai, kurie yra paruošti iš tikslių cheminių junginių kiekių, turi žinomą pastovią sudėtį ir yra lengvai atkuriami.

2. Konsistencija (tankis). Atskirkite aplinką:

• skystas;
• tankus;
• pusiau skystas.

Pastarieji du ruošiami iš specialių tirpalų arba skystų medžiagų, pridedant agaro-agaro arba želatinos, kad susidarytų reikiamas tankis. Be to, tanki aplinka bakterijoms daugintis yra sukrešėjęs kraujo serumas, bulvės, silikagelio terpė, karageninas.

3. Junginys. Šiuo pagrindu aplinkos yra:

• paprastas, kurių sąrašas trumpas – mėsos peptono sultinys (MBB), Hotingerio sultinys ir agaras, mėsos peptono agaras (MPA), maistinė želatina ir peptono vanduo.
• kompleksas, paruoštas iš paprastų, pridedant kraujo, išrūgų, angliavandenių ir kitų medžiagų.

4. Paskyrimas. Išskiriamos šios maistinės terpės:

• pagrindiniai yra naudojami daugybei patogeninių mikrobų auginti (dažniausiai paprastos sudėties);
• specialios yra naudojamos bakterijoms, kurios neauga ant paprastų substratų, išskirti ir kultivuoti;
• selektyvūs (jie taip pat yra selektyvūs) tinka tam tikro tipo bakterijoms išskirti ir slopina susijusių mikrobų augimą (selektyvumassukurtas į terpę pridedant tam tikrų medžiagų, pvz., antibiotikų ar druskų, arba reguliuojant pH);
• diferencinė diagnostika leidžia atskirti vienos rūšies bakterijas nuo kitų, įvertinus, pavyzdžiui, terpės fermentinį aktyvumą;
• konservantai reikalingi pirminiam inokuliavimui ir vėlesniam mėginių transportavimui, nes jie apsaugo nuo mikroorganizmų žūties, taip pat slopina kitų bakterijų augimą.

Žiniasklaidos rengimas

Svarbiausias anaerobinių bakterijų auginimo žingsnis yra tinkamos maistinės terpės paruošimas. Pasirinkę optimalius parametrus, pereikite prie šių etapų:

• svėrimas, analitiniuose svarstyklėje pasirenkant komponentų pavyzdį;
• tirpinimas atliekamas distiliuotame vandenyje, pašildytame iki 70 °C, o fosfatai, mikro ir makrodruskos ištirpinami atskirai;
• virimas vandens vonioje dvi minutes;
• pH nustatymas indikatoriniu popieriumi arba potenciometru;
• filtravimas per šlapią audinį arba popierinius filtrus skystoms ir išlydytoms tankioms terpėms ir per medvilnės marlės filtrą agaro terpei;
• išpilstymas atliktas 3/4 talpos;
• vidutinė priklausoma sterilizacija;
• sterilumo kontrolė atliekama dvi dienas nusėdus termostate, po to apžiūrint;
• cheminė kontrolė pH ir būtino kiekio nustatymuielementai;
• biologinė kontrolė bandomuoju inokuliavimu.

Stiklo dirbinių ir laikmenų sterilizavimas

Vienas pagrindinių bakterijų auginimo principų yra sterilumas. Svetimų mikroorganizmų augimas ir vystymasis gali paveikti maistinės terpės savybes, keisdamas jos cheminę sudėtį ir pH. Sterilizacija yra pagrindinė grynųjų kultūrų auginimo sąlyga. Praktiškai šis terminas reiškia absoliučiai visų gyvybės formų sunaikinimo sterilizuotų objektų paviršiuje ir tūryje būdus. Indai, instrumentai, terpės ir kiti tyrimo metu naudojami daiktai yra sterilizuojami.

Kai kurios sterilizacijos rūšys:

• Uždegimas. Sėjimo kilpų ir adatų, stiklinių stiklelių, kai kurių instrumentų sterilizavimas gali būti atliekamas naudojant degiklį arba spiritinę lempą.
• Verda. Tinka tvarkyti švirkštus, adatas, maistą, bet nenaikina bakterijų sporų.
• Sterilizacija sausu karščiu. Ji atliekama specialioje džiovinimo spintoje ir tinka kolboms, mėgintuvėliams ir kitiems laboratoriniams stikliniams indams apdoroti.
• Sterilizacija garais. Atliekamas autoklave, šis metodas yra labai efektyvus. Tačiau jis netinka maistinėms terpėms, kuriose yra b altymų ar kitų junginių, kurie skyla aukštoje temperatūroje. Labiau tausojantį galima vadinti tyndalizaciją. Jis atliekamas Koch katile ir sujungia sporų daigumą ir jų sunaikinimą.
• Pasterizavimas. Jis naudojamas terpėms, kurios verdamos keičia savo savybes (pavyzdžiui, pienas, vynas, alus), galinčiosišlaisvinti juos nuo sporų neturinčių mikroorganizmų. Apdorojimo temperatūra yra tik 50–60 ° C nuo penkiolikos iki trisdešimties minučių. Kai kuriais atvejais naudojama š alta sterilizacija, atliekama naudojant filtrus arba UV spindulius.

Bakterijų auginimo sąlygos

Bakterijų augimas ir vystymasis įmanomas tik esant tam tikriems veiksniams ir kiekvieno iš jų reikšmėms:

1. Temperatūra. Yra trys bakterijų grupės, kurios skiriasi pagal temperatūros nuostatas:

• termofilai, arba šilumą mėgstantys mikrobai, auga 45-90°C temperatūroje, vadinasi, jie nesidaugina žmonių ir gyvūnų organizmuose;
• psichrofilai arba š altį mėgstantys mikroorganizmai mėgsta 5–15 °C temperatūrą ir auginami šaldymo kamerose;
• mezofilai vystosi 25–37 °C temperatūroje, juose yra didžioji dalis bakterijų.

2. Šviesa. Tai yra fototrofinių bakterijų auginimo ypatybė, nes jos vykdo fotosintezės procesą. Tačiau daugumai mikrobų apšvietimas nėra būtina sąlyga. Ir net atvirkščiai, saulės ultravioletiniai spinduliai gali slopinti jų vystymąsi.

3. Vanduo. Visiems mikroorganizmams reikalingas prieinamas (skystas) vanduo. Štai kodėl šaldytame maiste bakterijos dauginasi mažai arba visai neauga.

4. Aplinkos rūgštingumas. Šis bakterijų auginimo principas jau buvo išsamiai aptartas aukščiau.

5. Aeracija. Deguonis, kaip cheminis elementas, yra neatsiejama vandens dalis ir daugybei naudojamų junginiųmikroorganizmų auginimas. Dujinio deguonies taip pat gali būti vandenyje ir kituose skysčiuose ištirpusio pavidalo. Didelę dalį bakterijų reikia nuolat aprūpinti deguonies molekulėmis. Tačiau daugeliui mikroorganizmų tai nereikalinga arba, dar blogiau, dujinis deguonis yra toksiškas, nes jie neturi katalazės ir peroksidazės, kurios naikina toksiškus kvėpavimo produktus. Todėl svarbiausias anaerobinių bakterijų auginimo žingsnis yra O₂ molekulių pašalinimas iš maistinės terpės.

6. Mikroorganizmų auginimas. Aerobinės ir anaerobinės bakterijos auginamos skirtinguose aplinkos sluoksniuose ir skirtingais režimais.

Aerobinių mikroorganizmų auginimas

Aerobinėms bakterijoms auginti reikalingas molekulinis deguonis. Norint gauti grynąsias aerobų kultūras, kurios gali būti sėkmingai naudojamos medicinoje ir maisto pramonėje, naudojami šie metodai:

• paviršius auga ant tankios terpės arba skystoje terpėje (jų plonas sluoksnis), kai deguonis patenka tiesiai iš oro;
• gilus kultivavimas skystose terpėse, kai jose ištirpusio deguonies kiekio padidėjimas pasiekiamas nuolat aeruojant.

Anaerobinių mikroorganizmų auginimas

Pagrindinis šio tipo bakterijų auginimo principas yra minimalus jų sąlytis su atmosferos deguonimi. Sudaryti sąlygas jiems augti yra daug sunkiau nei aerobams. Anaerobams iš molekulinio O₂:

naudojami šie metodai.

1. Fizinė. Šis anaerobinių bakterijų auginimo būdas yra sumažintas iki jų auginimo specialiame vakuuminiame aparate – mikroanaerostate. Oras jame pakeičiamas specialiu azoto dujų mišiniu, pridedant 10 % vandenilio ir 5 % anglies dioksido.
2. Cheminė. Tai apima: sugeriančių medžiagų naudojimą (pvz., Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) arba reduktorius (pvz., askorbo rūgštį).
3. Biologinis. Tai susiję su aerobų ir anaerobų auginimu uždaroje sistemoje. Šis bakterijų auginimo būdas apima vieną Petri lėkštelės pusę sėjamą su kai kuriomis aerobinėmis bakterijų rūšimis, o kitą pusę tiriamu anaerobu. Jo vystymasis prasidės tuo metu, kai bus sunaudotas visas deguonis.

Anaerobinėms bakterijoms auginti tinka šie sėjimo būdai:

• paviršiniame sluoksnyje;
• paviršiniame sluoksnyje, užpildytame steriliu parafinu;
• tirštos maistinės terpės tirštėje;
• giliuose klampios terpės sluoksniuose.

Grynosios kultūros gavimas

Mikrobiologai paprastai dirba su mėginiais, kuriuose gyvena daug skirtingų tipų mikrobų. Tačiau norint nustatyti mikroorganizmų (šeimos, genties, rūšies) sisteminę padėtį, taip pat ištirti jų savybes, būtina juos izoliuoti ir auginti grynąją kultūrą. Jie turi didelę reikšmę daugelyje maisto pramonės šakų, pavyzdžiui, sūrio, duonos, giros, vyno ir kt. Pieno rūgšties bakterijų auginimas leidžia gautibūtinas fermentuoto pieno produktų, tešlos, kakavos, siloso ir net plastiko gamybos komponentas.

Grynos kultūros išskyrimo tankioje terpėje metodas pagrįstas mechaniniu mikroorganizmų ląstelių atskyrimu, o vėliau jas izoliuojant. Mėginys perpilamas į sterilų vandens ar fiziologinio tirpalo tūrį (10–100 ml) ir purtomas dvi minutes. Norint išskirti mikroorganizmus, esančius tiriamos medžiagos storyje (pavyzdžiui, dešrelės ar sūris), pirmiausia steriliais instrumentais įtrinamas mėginio gabalėlis smėliu. Iš anksto paruošta medžiaga, sverianti 1 g arba 1 ml tūrio, skiedžiama steriliu vandeniu 10, 100, 1000 ir kt. kartų. Skiedimo laipsnis pasirenkamas taip, kad gautų ląstelių koncentraciją, atitinkančią metodo galimybes.

Vėliau mikroorganizmų auginimas yra maistinės terpės paruošimas. Dažniausiai pasirenkama tanki terpė (MPA). Iš pradžių išlydoma ir atšaldoma iki 45-50 °C, o tik po to supilama į keletą Petri lėkštelių (nuo trijų iki penkių gabalėlių), ant kurių dugno dedami įvairių koncentracijų tiriamosios medžiagos tamponai. Toliau maišoma dar neužšalusi maistinė terpė ir į ją įterpta medžiaga. Taip ląstelės fiksuojamos įvairiuose substrato tūrio taškuose.

Toliau Petri lėkštelės dedamos į termostatą 2 dienoms 22 °C temperatūroje. Per šį laiką ląstelės dauginasi tiek, kad kiekvienos ląstelės suformuota kolonija tampa matoma plika akimi. Kiekvienas iš jų yra gryna bakterijų, iš kurių ląstelių ji yra, kultūrarožė.

Po to iš Petri lėkštelių mikroorganizmai subkultūrinami į atskirus mėgintuvėlius, užpildytus maistine terpe. Tokiu būdu grynos kultūros išskiriamos iš mišraus mėginio. Šis metodas pavadintas jo kūrėjo R. Kocho vardu. Jis taip pat dažnai vadinamas puodelio metodu arba išsekimo būdu. Gavus grynąsias įvairių tipų bakterijų kultūras, nustatoma jų forma, sporos ir šeimos.

Visi darbai turi būti atliekami laikantis aseptikos principų. Siekiant išvengti ankstyvo mikroorganizmų vystymosi, tyrimas turi būti atliktas iš karto po mėginių paėmimo. Vanduo iš čiaupo analizuojamas išleidus pirmąsias porcijas, nes jose gali būti vamzdeliuose ir čiaupuose susikaupusių mikrobų. Vaisių, uogų ir daržovių mikroflora daugiausia išsidėsčiusi paviršiuje (žievelėse), todėl nuo jo atliekami plovimai. Norėdami tai padaryti, įdėkite vaisių į sterilų indą ir užpildykite jį reikiamu kiekiu vandens. Tada jie gana stipriai suplakami ir vanduo pilamas į kitą indą. Pasėliai iš audinių gaminių taip pat gaunami tamponais, tačiau prieš tai iš jų išpjaunami tam tikro dydžio gabaliukai.