Imobilizuotų fermentų samprata pirmą kartą pasirodė XX amžiaus antroje pusėje. Tuo tarpu dar 1916 metais buvo nustatyta, kad ant anglies sorbuota sacharozė išlaikė katalizinį aktyvumą. 1953 m. D. Schleitas ir N. Grubhoferis atliko pirmąjį pepsino, amilazės, karboksipeptidazės ir RNazės surišimą su netirpiu nešikliu. Imobilizuotų fermentų samprata buvo įteisinta 1971 m. Tai įvyko pirmojoje inžinerinės enzimologijos konferencijoje. Šiuo metu imobilizuotų fermentų sąvoka svarstoma platesne prasme, nei buvo XX amžiaus pabaigoje. Pažvelkime į šią kategoriją atidžiau.
Bendra informacija
Imobilizuoti fermentai yra junginiai, dirbtinai surišti su netirpiu nešikliu. Tačiau jie išlaiko savo katalizines savybes. Šiuo metu šis procesas nagrinėjamas dviem aspektais – dalinio ir visiško b altymų molekulių judėjimo laisvės apribojimo rėmuose.
Orumas
Mokslininkai nustatė tam tikrą imobilizuotų fermentų naudą. Veikdami kaip heterogeniniai katalizatoriai, juos galima lengvai atskirti nuo reakcijos terpės. Atliekant tyrimą buvo nustatyta, kad imobilizuotų fermentų naudojimas gali būti kartojamas. Įrišimo proceso metu jungtys keičia savo savybes. Jie įgauna substrato specifiškumą ir stabilumą. Tuo pačiu metu jų veikla pradeda priklausyti nuo aplinkos sąlygų. Imobilizuoti fermentai yra patvarūs ir pasižymi dideliu stabilumu. Jis tūkstančius, dešimtis tūkstančių kartų didesnis nei, pavyzdžiui, laisvųjų fermentų. Visa tai užtikrina aukštą technologijų, kuriose yra imobilizuoti fermentai, efektyvumą, konkurencingumą ir ekonomiškumą.
Žiniasklaida
J. Poratu nustatė pagrindines idealių medžiagų, naudojamų imobilizavimui, savybes. Nešėjai turi turėti:
- Netirpumas.
- Aukštas biologinis ir cheminis atsparumas.
- Galimybė greitai suaktyvinti. Nešėjai turėtų lengvai sureaguoti.
- Reikšmingas hidrofiliškumas.
- Būtinas pralaidumas. Jo indikatorius turėtų būti vienodai priimtinas tiek fermentams, tiek kofermentams, reakcijos produktams ir substratams.
Šiuo metu nėra medžiagos, kuri visiškai atitiktų šiuos reikalavimus. Nepaisant to, praktikoje naudojami nešikliai, tinkami imobilizuoti.tam tikros kategorijos fermentai tam tikromis sąlygomis.
Klasifikacija
Priklausomai nuo jų pobūdžio, medžiagos, su kuriomis junginiai paverčiami imobilizuotais fermentais, skirstomos į neorganines ir organines. Daugelio junginių surišimas atliekamas naudojant polimerinius nešiklius. Šios organinės medžiagos skirstomos į 2 klases: sintetines ir natūralias. Kiekviename iš jų savo ruožtu išskiriamos grupės, priklausomai nuo struktūros. Neorganinius nešiklius daugiausia sudaro medžiagos, pagamintos iš stiklo, keramikos, molio, silikagelio ir juodo grafito. Dirbant su medžiagomis populiarūs sausosios chemijos metodai. Imobilizuoti fermentai gaunami padengiant nešiklius titano, aliuminio, cirkonio, hafnio oksidų plėvele arba apdorojant organiniais polimerais. Svarbus medžiagų pranašumas yra regeneravimo paprastumas.
B altymų nešikliai
Populiariausios yra lipidinės, polisacharidinės ir b altyminės medžiagos. Tarp pastarųjų verta išskirti struktūrinius polimerus. Tai visų pirma apima kolageną, fibriną, keratiną ir želatiną. Tokie b altymai yra plačiai paplitę natūralioje aplinkoje. Jie yra prieinami ir ekonomiški. Be to, jie turi daug funkcinių grupių, skirtų surišimui. B altymai yra biologiškai skaidūs. Tai leidžia išplėsti imobilizuotų fermentų naudojimą medicinoje. Tuo tarpu b altymai turi ir neigiamų savybių. Imobilizuotų fermentų naudojimo ant b altymų nešėjų trūkumai yra didelis pastarųjų imunogeniškumas, taip patgalimybė į reakcijas įtraukti tik tam tikras jų grupes.
Polisacharidai, aminosacharidai
Iš šių medžiagų dažniausiai naudojamas chitinas, dekstranas, celiuliozė, agarozė ir jų dariniai. Kad polisacharidai būtų atsparesni reakcijoms, jų linijinės grandinės sujungiamos su epichlorhidrinu. Į tinklo struktūras laisvai įvedamos įvairios jonogeninės grupės. Chitinas dideliais kiekiais kaupiasi kaip atliekos pramoninio krevečių ir krabų perdirbimo metu. Ši medžiaga yra atspari chemikalams ir turi aiškiai apibrėžtą porėtą struktūrą.
Sintetiniai polimerai
Ši medžiagų grupė yra labai įvairi ir prieinama. Jį sudaro polimerai, pagaminti iš akrilo rūgšties, stireno, polivinilo alkoholio, poliuretano ir poliamido polimerų. Dauguma jų yra mechaniškai tvirti. Transformacijos procese jie suteikia galimybę keisti porų dydį gana plačiame diapazone, įtraukiant įvairias funkcines grupes.
Surišimo metodai
Šiuo metu yra dvi iš esmės skirtingos imobilizacijos galimybės. Pirmasis yra gauti junginius be kovalentinių ryšių su nešikliu. Šis metodas yra fizinis. Kitas variantas yra kovalentinio ryšio su medžiaga atsiradimas. Tai cheminis metodas.
Adsorbcija
Jo pagalba, laikant vaistą ant nešiklio paviršiaus, gaunami imobilizuoti fermentai dėldispersinė, hidrofobinė, elektrostatinė sąveika ir vandeniliniai ryšiai. Adsorbcija buvo pirmasis būdas apriboti elementų mobilumą. Tačiau ir dabar ši galimybė neprarado savo aktualumo. Be to, adsorbcija laikoma labiausiai paplitusiu imobilizacijos metodu pramonėje.
Metodo ypatybės
Mokslinėse publikacijose aprašyta daugiau nei 70 fermentų, gautų adsorbcijos metodu. Nešėjai daugiausia buvo akytas stiklas, įvairūs moliai, polisacharidai, aliuminio oksidai, sintetiniai polimerai, titanas ir kiti metalai. Pastarieji yra dažniausiai naudojami. Vaisto adsorbcijos ant nešiklio efektyvumą lemia medžiagos poringumas ir specifinis paviršiaus plotas.
Veikimo mechanizmas
Fermentų adsorbcija ant netirpių medžiagų yra paprasta. Jis pasiekiamas vandeniniam vaisto tirpalui kontaktuojant su nešikliu. Jis gali praeiti statiškai arba dinamiškai. Fermento tirpalas sumaišomas su šviežiomis nuosėdomis, pavyzdžiui, titano hidroksidu. Tada junginys džiovinamas švelniomis sąlygomis. Fermentų aktyvumas tokios imobilizacijos metu išlaikomas beveik 100 proc. Tuo pačiu metu specifinė koncentracija pasiekia 64 mg viename grame nešiklio.
Neigiamos akimirkos
Adsorbcijos trūkumai yra mažas stiprumas jungiantis fermentą ir nešiklį. Keičiant reakcijos sąlygas, galima pastebėti elementų praradimą, produktų užteršimą ir b altymų desorbciją. Norėdami pagerinti jėgąįrišimo nešikliai yra iš anksto modifikuoti. Visų pirma, medžiagos yra apdorojamos metalo jonais, polimerais, hidrofobiniais junginiais ir kitomis polifunkcinėmis medžiagomis. Kai kuriais atvejais pats vaistas yra modifikuojamas. Tačiau gana dažnai dėl to sumažėja jo aktyvumas.
Įtraukimas į gelį
Ši parinktis yra gana įprasta dėl savo unikalumo ir paprastumo. Šis metodas tinka ne tik atskiriems elementams, bet ir kelių fermentų kompleksams. Įterpti į gelį galima dviem būdais. Pirmuoju atveju vaistas derinamas su vandeniniu monomero tirpalu, po kurio atliekama polimerizacija. Dėl to atsiranda erdvinė gelio struktūra, kurioje ląstelėse yra fermentų molekulių. Antruoju atveju vaistas įvedamas į gatavo polimero tirpalą. Tada jis perkeliamas į gelio būseną.
Įsibrovimas į permatomas struktūras
Šio imobilizacijos metodo esmė – vandeninio fermento tirpalo atskyrimas nuo substrato. Tam naudojama pusiau pralaidi membrana. Jis leidžia mažos molekulinės masės kofaktorių ir substratų elementams praeiti ir išlaiko dideles fermentų molekules.
Mikrokapsuliacija
Yra keletas įterpimo į permatomas struktūras parinkčių. Iš jų didžiausią susidomėjimą kelia mikrokapsuliavimas ir b altymų įtraukimas į liposomas. Pirmąjį variantą 1964 metais pasiūlė T. Changas. Jį sudaro tai, kad fermento tirpalas įpilamas į uždarą kapsulę, kurios sienelės pagamintos iš pusiau laidžios.polimeras. Membranos atsiradimą ant paviršiaus sukelia junginių sąsajos polikondensacijos reakcija. Vienas iš jų yra ištirpęs organinėje, o kitas – vandeninėje fazėje. Pavyzdys yra mikrokapsulės susidarymas, gautas polikondensuojant sebaco rūgšties halogenidą (organinė fazė) ir heksametilendiaminą-1,6 (atitinkamai, vandeninė fazė). Membranos storis skaičiuojamas šimtosiomis mikrometro dalimis. Kapsulių dydis yra šimtai ar dešimtys mikrometrų.
Inkorporavimas į liposomas
Šis imobilizacijos metodas yra artimas mikrokapsuliavimui. Liposomos pateikiamos lamelinėse arba sferinėse lipidų dvisluoksnių sistemose. Šis metodas pirmą kartą buvo panaudotas 1970 m. Norint išskirti liposomas iš lipidų tirpalo, organinis tirpiklis išgarinamas. Likusi plona plėvelė disperguojama vandeniniame tirpale, kuriame yra fermento. Šio proceso metu lipidų dvisluoksnės struktūros savaime susirenka. Tokie imobilizuoti fermentai yra gana populiarūs medicinoje. Taip yra dėl to, kad dauguma molekulių yra lokalizuotos biologinių membranų lipidinėje matricoje. Imobilizuoti fermentai, esantys į liposomas, yra svarbiausia medicinos tyrimų medžiaga, leidžianti ištirti ir apibūdinti gyvybinių procesų dėsningumus.
Naujų obligacijų formavimas
Imobilizavimas formuojant naujas kovalentines grandines tarp fermentų ir nešėjų yra laikomas plačiausiai paplitusiu pramoninių biokatalizatorių gavimo būdu. Kelionės tikslas. Skirtingai nuo fizinių metodų, ši parinktis užtikrina negrįžtamą ir stiprų ryšį tarp molekulės ir medžiagos. Jo susidarymą dažnai lydi vaistų stabilizavimas. Tuo pačiu metu fermento vieta 1-osios kovalentinės jungties atstumu nuo nešiklio sukuria tam tikrų sunkumų įgyvendinant katalizinį procesą. Molekulė nuo medžiagos atskiriama įdėklu. Jis dažnai naudojamas kaip poli- ir bifunkcinis agentas. Visų pirma, tai yra hidrazinas, cianogeno bromidas, glutaro dialhedridas, sulfurilchloridas ir kt. Pavyzdžiui, norint pašalinti galaktoziltransferazę, tarp nešiklio ir fermento įterpiama tokia seka -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. Esant tokiai situacijai, struktūroje yra įdėklas, molekulė ir nešiklis. Visi jie yra sujungti kovalentiniais ryšiais. Esminę reikšmę turi būtinybė į reakciją įtraukti funkcines grupes, kurios nėra būtinos elemento katalizinei funkcijai. Taigi, kaip taisyklė, glikoproteinai prie nešiklio prisijungia ne per b altymą, o per angliavandenių dalį. Dėl to gaunami stabilesni ir aktyvesni imobilizuoti fermentai.
Ląstelės
Aukščiau aprašyti metodai laikomi universaliais visų tipų biokatalizatoriams. Tai, be kita ko, apima ląsteles, tarpląstelines struktūras, kurių imobilizavimas pastaruoju metu tapo plačiai paplitęs. Taip yra dėl šių priežasčių. Kai ląstelės yra imobilizuotos, nereikia išskirti ir gryninti fermentų preparatų arba į reakcijas įvesti kofaktorių. Dėl to tampa įmanomasistemos, kurios vykdo daugiapakopius nuolatinius procesus.
Imobilizuotų fermentų naudojimas
Veterinarijoje, pramonėje ir kituose ūkio sektoriuose vaistai, gauti aukščiau nurodytais metodais, yra gana populiarūs. Praktikoje sukurti metodai išsprendžia tikslinio vaistų tiekimo į organizmą problemas. Imobilizuoti fermentai leido gauti ilgalaikio veikimo vaistus, turinčius minimalų alergiškumą ir toksiškumą. Šiuo metu mokslininkai mikrobiologiniais metodais sprendžia problemas, susijusias su masės ir energijos biokonversija. Tuo tarpu imobilizuotų fermentų technologija taip pat svariai prisideda prie darbo. Plėtros perspektyvos atrodo gana plačios. Taigi ateityje vienas iš pagrindinių vaidmenų aplinkos būklės stebėjimo procese turėtų priklausyti naujoms analizės rūšims. Visų pirma kalbame apie bioliuminescencinius ir fermentų imunologinius tyrimus. Pažangūs metodai yra ypač svarbūs apdorojant lignoceliuliozės žaliavas. Imobilizuoti fermentai gali būti naudojami kaip silpno signalo stiprintuvai. Aktyvus centras gali būti veikiamas nešiklio, kuris yra veikiamas ultragarsu, mechaniniu poveikiu arba fitocheminių transformacijų.
