Tiriant medžiagas organinėje chemijoje, tam tikrų junginių kiekiui nustatyti naudojama daugiau nei dešimt skirtingų kokybinių reakcijų. Tokia vizuali analizė leidžia iš karto suprasti, ar yra reikalingų medžiagų, o jei jų nėra, galima žymiai sumažinti tolesnius eksperimentus joms nustatyti. Šios reakcijos apima ninhidriną, kuris yra pagrindinis vizualiai nustatant amino junginius.
Kas tai?
Ninhidrinas yra dikarbonilo junginys, turintis vieną aromatinį žiedą su prie jo prijungtu heterociklu, kurio antrasis atomas turi 2 hidroksilo grupes (OH-). Ši medžiaga gaunama tiesiogiai oksiduojant inandioną - 1, 3, todėl pagal tarptautinę nomenklatūrą ji turi tokį pavadinimą: 2, 2 - dihidroksiandionas -1, 3 (1 pav.).
Grynas ninhidrinas yra geltonas arba b altas kristalasspalvos, kurios kaitinamos gerai ištirpsta vandenyje ir kituose poliniuose organiniuose tirpikliuose, pavyzdžiui, acetone. Tai gana kenksminga medžiaga, jei jos dideliais kiekiais patenka ant odos arba ant gleivinių, sukelia dirginimą, taip pat ir įkvėpus. Dirbkite su šiuo junginiu atsargiai ir tik mūvėkite pirštines, nes patekęs ant odos, jis reaguoja su odos ląstelių b altymais ir nudažo ją purpurine spalva.
Reaktyviosios medžiagos
Kaip minėta, ninhidrino reakcija visų pirma naudojama vizualiniam amino junginių kiekiui nustatyti:
- α-aminorūgštys (įskaitant b altymus);
- aminocukrus;
- alkaloidai, kurių sudėtyje yra –NH2 ir -NH grupių;
- įvairūs aminai.
Pažymėtina, kad antriniai ir tretiniai aminai kartais reaguoja labai silpnai, todėl norint patvirtinti jų buvimą reikia atlikti daugiau tyrimų.
Kiekybiniam nustatymui naudojami įvairūs chromatografijos metodai, pavyzdžiui, popieriaus chromatografija (BC), plonasluoksnė chromatografija (TLC) arba kietųjų nešėjų plovimas ninhidrino tirpalu įvairiose terpėse.
Ši reakcija nėra būdinga amino junginiams, nes reagentas gali patekti į ją su visais iš karto. Tačiau iš reakcijos produktų pusės išsiskiria anglies dioksido burbuliukų (CO2) forma, ir tai būdinga tik sąveikaujant su α-amino. rūgštys.
Mechanizmo savybės
BLiteratūroje yra įvairių ninhidrino reakcijos lygties aiškinimų. Kai kurie tyrinėtojai neįtraukia hidrindatino susidarymo iš 2-aminoindiono, kuris, dalyvaujant amoniakui ir ninhidrinui, taip pat sudaro dažančiąją medžiagą, vadinamą „Ruemano purpurine“(arba „Ruemano mėlyna“), o kiti, priešingai, daro prielaidą tik jo. dalyvavimas be tarpinių amino produktų. Pačios reakcijos įraše taip pat yra keletas įdomių punktų, ypač tai susiję su ninhidrino aminodarinio prijungimo prie pagrindinės molekulės būdais, kad susidarytų dažiklis. Abejonių kelia ir „vaikščiojančio vandenilio“, gauto tarpinio amino iš vandeninės terpės, vietos nurodymas: jis gali būti arba ketonų grupėje, arba šalia –NH2.
Iš tikrųjų niuansas su H atomu yra nereikšmingas, nes jo padėtis junginyje nevaidina ypatingo vaidmens reakcijos eigoje, todėl nereikėtų į tai kreipti dėmesio. Kalbant apie vienos iš galimų etapų praleidimą, priežastis čia slypi teoriniame aspekte: iki šiol nebuvo tiksliai nustatytas tikslus Ruemano purpurinės spalvos susidarymo mechanizmas, todėl galima rasti gana skirtingų ninhidrino reakcijos schemų.
Išsamiausias įmanomas reagento sąveikos su amino junginiais kursas bus pasiūlytas toliau.
Reakcijos mechanizmas
Pirma, ninhidrinas sąveikauja su α-aminorūgštimi, prijungdamas ją prie hidroksigrupių skilimo vietos ir sudarydamas kondensacijos produktą (2a pav.). Tada pastarasis sunaikinamas, išskiriant tarpinį aminą, aldehidą ir anglies dioksidą (2b pav.). Nuo galutinio produkto prisijungiantninhidrinas, susintetinama Rueman purpurinė struktūra (diketonhidrindenketohidrinaminas, 2c pav.). Taip pat nurodomas galimas hidrindantino (redukuoto ninhidrino) susidarymas iš tarpinio amino, kuris, esant amoniakui (tiksliau amonio hidroksidui) su paties reagento pertekliumi, taip pat virsta dažančiu junginiu (2d pav.).
Hidrindantino susidarymą įrodė pats Ruemanas, kai vandenilio sulfidas veikia ninhidrino molekulę. Šis junginys gali ištirpti natrio karbonate Na2CO3, nuspalvindamas tirpalą tamsiai raudonai. O kai įpilama praskiestos druskos rūgšties, hidrindantinas nusėda.
Greičiausiai tarpinis aminas, hidridantinas, ninhidrinas ir dažiklio struktūra dėl nestabilumo kaitinant yra tam tikroje pusiausvyroje, todėl gali būti keletas papildomų etapų.
Šis mechanizmas tinka paaiškinti ninhidrino reakciją su kitais amino junginiais, išskyrus šalutinius produktus, atsirandančius pašalinus likusią struktūrą iš –NH2, -NH arba -N.
Biureto testas ir kitos reakcijos į b altymus
Kokybinė net neb altyminių struktūrų peptidinių ryšių analizė gali būti atliekama ne tik dalyvaujant aukščiau nurodytam reagentui. Tačiau ninhidrino reakcijos į b altymus atveju sąveika vyksta ne pagal –CO-NH‒ grupes, o išilgai aminų grupių. Yra vadinamoji „biureto reakcija“, kuriai būdinga jonų pridėjimas į tirpalą su amino junginiais.dvivalentis varis iš CuSO4 arba Cu(OH)2 šarminėje terpėje (3 pav.).
Atliekant analizę, esant reikalingoms struktūroms, tirpalas nusidažo tamsiai mėlynai dėl peptidinių jungčių susijungimo į spalvų kompleksą, kuris išskiria vieną reagentą nuo kito. Štai kodėl biureto ir ninhidrino reakcijos yra universalios b altymų ir neb altyminių struktūrų, turinčių –CO-NH‒ grupę, atžvilgiu.
Nustatant ciklines aminorūgštis, naudojama ksantoproteino reakcija su koncentruotu azoto rūgšties tirpalu HNO3 , kuri nitrindama suteikia geltoną spalvą. Reagento lašas ant odos taip pat įgauna geltoną spalvą, reaguodamas su odos ląstelėse esančiomis aminorūgštimis. Azoto rūgštis gali nudeginti, todėl su ja taip pat reikia mūvėti pirštines.
Sąveikos su amino junginiais pavyzdžiai
Ninhidrino reakcija į α-aminorūgštis duoda gerą vizualinį rezultatą, išskyrus spalvotąsias prolino ir hidroksiprolino struktūras, kurios reaguoja susidarant geltonai spalvai. Galimas šio poveikio paaiškinimas buvo rastas kitomis ninhidrino sąveikos su šiomis struktūromis aplinkos sąlygomis.
Reakcija su aminogrupe
Kadangi testas nėra specifinis, vizualiai aptikti alanino, naudojant mišinio ninhidrino reakciją, neįmanoma. Tačiau naudojant popieriaus chromatografiją, naudojant įvairių α-amino rūgščių mėginius, purškiant juos vandeniniu ninhidrino tirpalu ir išryškinant specialioje terpėje, galima.apskaičiuokite ne tik nurodyto junginio, bet ir daugelio kitų kiekybinę sudėtį.
Schemiškai alanino sąveika su ninhidrinu vyksta tuo pačiu principu. Jis prisijungia prie reagento prie amino grupės ir, veikiant aktyviems hidronio jonams (H3O+), atsiskiria nuo anglies. -azoto jungtis, suyra į acetaldehidą (CH3COH) ir anglies dioksidą (CO2). Dar viena ninhidrino molekulė prisijungia prie azoto, išstumdama vandens molekules ir susidaro spalvinimo struktūra (4 pav.).
Reakcija su heterocikliniu amino junginiu
Ninhidrino reakcija su prolinu yra specifinė, ypač atliekant chromatografines analizes, nes tokios struktūros rūgščioje terpėje pirmiausia pagelsta, o neutralioje – purpurinės spalvos. Tyrėjai tai paaiškina tarpinio junginio ciklo pertvarkymo ypatybe, kuriai įtakos turi būtent daug vandenilio protonų, kurie papildo išorinį azoto energijos lygį.
Heterociklas nesunaikinamas, o prie jo 4-ajame anglies atome prisijungia kita ninhidrino molekulė. Toliau kaitinant, gauta struktūra neutralioje terpėje virsta Rueman purpurine spalva (5 pav.).
Pagrindinio reagento paruošimas
Ninhidrino tyrimas atliekamas su skirtingais tirpalais, priklausomai nuo amino struktūrų ištirpimo tam tikrose organinėse irneorganiniai junginiai.
Pagrindinis reagentas yra 0,2 % tirpalo vandenyje paruošimas. Tai universalus mišinys, nes dauguma junginių gerai ištirpsta H2O. Norint gauti šviežiai paruoštą reagentą, 0,2 g chemiškai gryno ninhidrino mėginys praskiedžiamas 100 ml vandens.
Verta pažymėti, kad kai kuriems analizuojamiems tirpalams šios koncentracijos nepakanka, todėl galima paruošti 1% arba 2% tirpalus. Tai būdinga vaistinių žaliavų ekstraktams, nes juose yra įvairių klasių amino junginių.
Atliekant chromatografinius tyrimus, tirpalai, pavyzdžiui, plaunant mišinį ant kieto nešiklio per kolonėlę, gali būti ruošiami alkoholyje, dimetilsulfokside, acetone ir kituose poliniuose tirpikliuose – viskas priklausys nuo tam tikro tirpiklio. amino struktūros.
Programa
Ninhidrino reakcija leidžia aptikti daug amino junginių tirpale, todėl jis buvo vienas pirmųjų panaudotų organinių medžiagų kokybinei analizei. Vizualinis nustatymas žymiai sumažina eksperimentų skaičių, ypač analizuojant prastai ištirtus augalus, vaistus ir dozavimo formas, taip pat nežinomus tirpalus ir mišinius.
Teismo medicinoje šis metodas plačiai naudojamas prakaito žymėms ant bet kurio paviršiaus nustatyti.
Nepaisant reakcijos nespecifiškumo, ninhidrino reakcijos pašalinimas iš cheminės praktikos neįmanomas, nespakeitus šią medžiagą mažiau toksiškais analogais (pavyzdžiui, oksolinu), paaiškėjo, kad jų jautrumas amino grupėms yra prastesnis ir fotometrinės analizės rezultatai neduoda gerų rezultatų.
