Gramo beicas plačiai naudojamas mikrobiologijoje, nes tai vienas iš paprasčiausių būdų atskirti bakterijas pagal jų ląstelės sienelės sudėtį. Pagal gramą visas bakterijas galima suskirstyti į gramteigiamas (Gram (+)) ir gramneigiamas (Gram (-)). Gramo beicavimo metodas buvo sukurtas 1884 m. ir nuo to laiko neprarado populiarumo, nors buvo keletą kartų modifikuotas.
Ląstelės sienelės struktūra
Dažymas gramais parodo, ar bakterija yra gramteigiama, ar gramneigiama. Bakterijos skirstomos į gramus (+) ir gramus (-) pagal jų ląstelės sienelės struktūrą.
Ląstelės sienelėje yra didžiausias kiekis peptidoglikano (mureino) – sudėtingos medžiagos, kurią sudaro peptapeptidas ir glikanas. Glikanas susideda iš kintančių N-acetilgliukozamino ir N-acetilmuramo rūgšties liekanų, sujungtų viena su kita β-1,4-glikozidinės jungtys. Peptidoglikanas užtikrina ląstelių formos palaikymą, osmosinę apsaugą ir antigenines funkcijas.
Pagrindiniai gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų skirtumai
Skirtingos bakterijos turi skirtingą peptidoglikano sluoksnio storį. Bakterijose, kurios klasifikuojamos kaip gramteigiamos, jis svyruoja nuo 15 iki 80 nm, o gramneigiamų - nuo 2 iki 8 nm. Tuo pačiu metu gramneigiamos bakterijos po peptidoglikano sluoksniu turi specialią struktūrą, kurios gramteigiamos bakterijos neturi – periplazminę erdvę. Ši erdvė užpildyta hidroliziniais fermentais – β-laktamaze, ribonukleaze 1, fosfataze. Būtent šie fermentai yra atsakingi už gramneigiamų bakterijų atsparumą daugeliui antibiotikų.
Gram(-) peptidoglikano bakterijų sluoksnis yra susietas su lipopolisacharidu – antigenine struktūra, kurioje yra endotoksino. Gram(+) bakterijose techo rūgštys atlieka panašias funkcijas.
Gramneigiamos bakterijos turi papildomą struktūrą – išorinę membraną.
Dažymo metodo esmė
Prieš pradedant dažymą, paruošiami tirtų bakterijų tepinėliai. Norėdami tai padaryti, ant stiklinio stiklelio lašinamas vanduo ir ten su bakterine kilpa pridedama mikroorganizmų kultūra. Tada, visiškai išdžiūvus vandeniui, tepinėlis fiksuojamas – stiklinė stiklinė kelis kartus pernešama virš degiklio liepsnos. Dažymas gramais yra veiksmingesnis nei dažymas gyvomis bakterijomis – dažų molekulės geriau jungiasi prie negyvų ląstelių.
Dažymas atliekamas keliais etapais:
- Maži filtravimo popieriaus gabalėliai uždedami ant fiksuoto tepinėlio ir pilamas pagrindinis dažiklis – gencijonų violetinė arba metileno mėlyna.
- Po 3–5 minučių nuimkite spalvotą filtravimo popierių ir 1 minutę užpildykite tepinėlį Lugolio tirpalu. Tokiu atveju preparatas patamsėja.
- Lugolio tirpalas nusausinamas, o tepinėlis apdorojamas grynu etilo alkoholiu: ant preparato užlašinami keli lašai, po 20 sekundžių nupilama. Procedūra kartojama 2-3 kartus.
- Skalaukite stiklelį su bandomuoju paruošimu distiliuotu vandeniu.
- Pagaminti papildomą dažymą – paruošimą užbaikite fuksinu. Po 1-2 minučių dažai nuplaunami.
- Kai vanduo išdžiūsta, mikroskopu apžiūrėkite tepinėlį. Gramteigiamos bakterijos bus mėlynai violetinės spalvos, gramneigiamos – rausvos arba raudonos.
Skirtingų dėmių raštų priežastys
Kaip aprašyta aukščiau, gramteigiamos bakterijos nusidažo mėlynai violetine spalva, o gramneigiamos – raudona arba rausva. Skirtingo bakterijų dažymo šiuo metodu priežastis yra ta, kad po to, kai tirpi gencijonų violetinė forma patenka į ląstelę, dažai pereina į netirpią jodo formą. Apdorojant bakterijas etilo alkoholiu, veikiant šiam nepoliniam tirpikliui iš membranos išskiriami lipidai. Tada membrana tampa porėta ir nebėra reikšminga kliūtis dažų išplovimui. Tačiaupeptidoglikanas yra atsparesnis nepoliniams tirpikliams, įskaitant alkoholį. Būtent jis neleidžia išplauti dažų, todėl bakterijos su storu mureino sluoksniu tampa mėlynai violetinės (gramteigiamos), o po apdorojimo alkoholiu spalvos nepakeičia.
Plonas gramneigiamų bakterijų mureino sluoksnis negali išlaikyti dažų molekulių ląstelėje, todėl veikiant alkoholiui jos tampa bespalvės – nusidažo gramneigiamai.
Paveikus tepinėlį fuksinu, gramu nudažytos bakterijos išlieka mėlynai violetinės, o gramneigiamos bakterijos tampa rausvai raudonos.
Gram(+) ir Gram(-) bakterijų pavyzdžiai
Gramneigiamos bakterijos apima cianobakterijas, sieros bakterijas, geležies bakterijas, chlamidijas, riketsijas, acto bakterijas, daug metilobakterijų, tionines bakterijas, arsenitobakterijas, karboksibakterijas.
Bifidobakterijos, daugelis vandens bakterijų, streptokokai ir stafilokokai yra gramteigiamos.
